微生物檢測基礎(chǔ)知識(shí)及常見消毒滅菌方式匯總
一、微生物的概念與分類
在自然界里，有許多肉眼不能直接看見，必須借助于顯微鏡放大才能觀察到微小生物，這些微小生物總稱為微生物。
微生物的分類，目前公認(rèn)的包括七大類。即病毒→立克次體→支原體→細(xì)菌→放線菌→螺旋體→真菌(酵母菌、霉菌)。排在前面的小而低等，排在后面的逐漸大而高等，本文內(nèi)容只重點(diǎn)介紹三類。
二、微生物的特點(diǎn)
微生物除了個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單這一基本特征以外，還有一些其他特點(diǎn)也是與眾多生物不同的。
(一)種類繁多
微生物的數(shù)量和種類是十分驚人的。一滴水，一顆土粒往往都是一個(gè)微生物“社會(huì)”。其中以土壤內(nèi)的生存密度最大，1克較肥活的土壤常含有幾億到幾十億個(gè)微生物;貧瘠土壤每克也含有幾百萬到幾千萬個(gè)，一只骯臟的蒼蠅，全身能攜帶5億多個(gè)細(xì)菌。
三對足能粘附700萬至1000萬個(gè)細(xì)菌，可見微生物的密集度之大。微生物的各類也很可觀，自然界已知的微生物就有10萬種左右。
(二)分布廣泛
微生物是地球上分布最廣泛的一類生物。在遼闊的自然界中，無論土壤、水域、空氣以及動(dòng)物、植物、人體內(nèi)外都有大量微生物存在。有些微生物能夠在異常的條件下生存，例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活，嗜熱菌能在溫度高達(dá)98℃以上的溫泉中生活，有的甚至在高達(dá)200～300℃的深?；鹕娇诟浇材芑顒?dòng)，嗜鹽菌在含鹽量高達(dá)23%～25%的死海里，甚至30%的摘錄化鈉溶液中和鹽塊上存活，顯然這是一般生物所望塵莫及的。
(三)繁殖迅速
微生物的繁殖速度也是同樣驚人的，比高等動(dòng)植物快得多，有些細(xì)菌，在適宜條件下每20分鐘就可以繁殖一次，例如大腸桿菌，1個(gè)細(xì)菌經(jīng)20分鐘就分裂成2個(gè)，每小時(shí)可分裂3次，這樣，1個(gè)細(xì)菌繁殖3代就產(chǎn)生8個(gè)細(xì)菌。即：
1小時(shí) =8個(gè)
2小時(shí) 8×23=64個(gè)
3小時(shí) 64×23=512個(gè)
4小時(shí) 512×23=4096個(gè)
24小時(shí) 1×272=4.7*1021
照此速度繁殖下去，24小時(shí)就可繁殖72代，數(shù)量大約為4.7*1021個(gè)。所以細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)就可以看見菌群。其增殖速率是相當(dāng)驚人的。但因種種條件(營養(yǎng)物質(zhì))限制，這種繁殖速度是不能持久的。盡管如此，微生物這種快速繁殖能力應(yīng)用到工業(yè)發(fā)酵上，在短時(shí)間內(nèi)得到大量增殖，收或較多的產(chǎn)物，也是有著重要意義的。
三、常見的微生物
(一)細(xì)菌
細(xì)菌是能夠獨(dú)立地進(jìn)行生長繁殖的單細(xì)胞生物，種類很多，大小不一，平均約1.0μm，用顯微鏡放大1000倍，也只有1.0mm大小，所以肉眼看不見。
細(xì)菌的形態(tài)是不完全相同的，一般可歸納為三種類型：
1.球菌單獨(dú)存在時(shí)呈球形，按其分裂的方式和分裂后的排列，可分為單球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等，菌體直徑約0.5～1.0μm。
2.桿菌菌體呈桿狀或近似桿狀。大小、長短、粗細(xì)很不一致，有的粗短近似球菌，稱為球桿菌;有的桿菌一端膨大似棒狀，稱為棒狀桿菌;有的排列成鏈狀，稱為鏈桿菌;有的生長成側(cè)枝，稱為分枝桿菌。大部分桿菌長約2.0～3.0μm，寬0.5～1.0μm，病原細(xì)菌中桿菌的種類最多。
3.弧菌和螺菌菌體呈彎曲或螺旋狀，只有一個(gè)彎曲，呈逗點(diǎn)狀為弧菌，如霍亂弧菌;有數(shù)個(gè)彎曲較為堅(jiān)韌的為螺菌，如鼠咬熱螺菌。
(二)病毒
病毒是體積最小，結(jié)構(gòu)最簡單，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而只能寄生在其它生物的細(xì)胞內(nèi)，利用宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖的原始生物。病毒的形態(tài)多數(shù)呈球形，少數(shù)呈桿狀或磚塊狀，細(xì)菌病毒(噬菌體)多數(shù)呈蝌蚪狀，平均大小只有0.1μm，比細(xì)菌約小10倍，最小的病毒只有0.01μm，接近蛋白質(zhì)分子。病毒大多能通過濾菌器，故俗稱濾過性病毒。
豬流感病毒
(三)真菌
真菌是體積最大，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的微生物。真菌在自然界里廣泛存在，如使衣物、食品發(fā)霉的霉菌，釀酒或發(fā)醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也較常見，如皮膚淺表的癬菌。真菌對熱的抵抗力不強(qiáng)，60℃加熱1小時(shí)即被殺死。真菌分單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌;單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌;單細(xì)胞真菌通稱為酵母菌。多細(xì)胞真菌通稱為霉菌。
酵母菌
酵母菌
霉菌
黑曲霉
四、細(xì)菌細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)
有的細(xì)菌除具有上述基本結(jié)構(gòu)外，尚有某些特殊結(jié)構(gòu)，如莢膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。
1.莢膜
有些細(xì)菌在一定的營養(yǎng)條件下，向細(xì)胞壁表面分泌一種粘液狀物質(zhì)，形成一層較厚的膜(約0.2μm)稱為莢膜。莢膜中含有大量水分，莢膜對菌體有保護(hù)作用，可保護(hù)細(xì)菌抵抗干燥。細(xì)菌的莢膜與細(xì)菌的致病力有關(guān)，具有莢膜的細(xì)菌不易被白細(xì)胞所吞噬，故能在機(jī)體內(nèi)生長繁殖，引起感染。
2.芽胞
某些細(xì)胞生長到一定時(shí)期或當(dāng)外界條件改變時(shí)對細(xì)菌生長不利時(shí)，菌體內(nèi)的細(xì)胞漿發(fā)生脫水濃縮，逐漸形成圓形或橢圓形的小體，位于菌體中央或末端，稱為芽胞，如下圖所示，芽胞是細(xì)菌的休眠體，一個(gè)繁殖體只能形成一個(gè)芽胞。芽胞外部有數(shù)層厚而致密的膜，可抵御外界不良的環(huán)境，對于高溫、干燥、光線、化學(xué)藥品等有抵抗力比繁殖體為強(qiáng)，沒有形成芽胞的細(xì)菌，在70℃以上就逐漸死亡，而芽胞卻能抵抗100℃或更高一些的溫度。因此，殺死芽胞要比殺死細(xì)菌的繁殖體困難得多，有的芽胞存活多年而不喪失其活力，當(dāng)遇到合適條件又可生長繁殖，因此滅菌的效果應(yīng)以殺死芽胞為標(biāo)準(zhǔn)。
細(xì)菌芽孢
五、細(xì)菌的生長繁殖和代謝產(chǎn)物
1.細(xì)菌的繁殖方式
細(xì)菌的繁殖方式是簡單無性二分裂法，即一個(gè)細(xì)菌分為二個(gè)，二個(gè)分為四個(gè)，如此繼續(xù)下去。球菌由于沿著一個(gè)平面或幾個(gè)平面，故呈鏈狀、葡萄狀、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌等狀態(tài);桿菌一般沿橫軸分裂。
大部分細(xì)菌的繁殖速度很快，如大腸桿菌在適宜的條件下，每20分鐘就可繁殖一代，若保持此速度繁殖10小時(shí)后，一個(gè)細(xì)菌可以繁殖10億個(gè)。細(xì)菌繁殖雖然如此迅速，但它是受各方面因素所制約，決不能無限制地繁殖下去。
2.生長繁殖的條件
1) 水細(xì)菌的生長繁殖是從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)，通過本身含有的許多酶系統(tǒng)，進(jìn)行一系列的生化反應(yīng)分解轉(zhuǎn)化成簡單物質(zhì)，然后加以吸收利用。水是細(xì)菌生活所不可缺水的物質(zhì)。
2)碳和氮化合物、無機(jī)鹽等這些是細(xì)菌營養(yǎng)所必須的物質(zhì)。
3)氣體氧、二氧化碳和氮與細(xì)菌的生長繁殖有密切的關(guān)系。有些細(xì)菌必須有充分的氧氣供應(yīng)才能生活，稱為需氧菌，如結(jié)核桿菌;另一類則恰相反，要在缺氧的環(huán)境下才能生活，有氧存在反而對它們生長不利，稱為厭氧菌，如破傷風(fēng)桿菌;大多數(shù)但致病菌處于這兩者之間，有氧無氧都生活的則稱為兼性厭氧菌，如大腸桿菌。
(4)酸堿度大多數(shù)病原菌生長最適宜的酸堿度為pH7.2～7.6。
(5)溫度根據(jù)細(xì)菌對溫度要求的不同，可分為嗜冷菌、嗜溫菌及嗜熱菌。一般病原菌的適宜溫度基本與人類體溫相同，因而實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)菌均采用37℃。(霉菌25℃)
3.代謝產(chǎn)物
細(xì)菌在生長繁殖中，可產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，有的分泌到菌體外面，有的包含在菌內(nèi)，有一些代謝產(chǎn)物對人體有益，如抗生素、維生素等;但有一些代謝產(chǎn)物對人體是有害的，如熱原等，這些產(chǎn)物一旦進(jìn)入機(jī)體可以致病或使體溫升高。
六、外界環(huán)境中對微生物生長的影響因素
1.溫度和化學(xué)因素溫度和化學(xué)因素對微生物的生長繁殖影響極大，將在物理滅菌法和化學(xué)滅菌法中講述。
2.pH值pH值對微生物生長的影響 ，中性繁殖最快。
3.濕度溫度可以促使細(xì)菌生長，特別對霉菌繁育更快。因此防止?jié)穸冗^大對于避免染菌霉敗有一定的作用。
水的活度對細(xì)菌生長的重要性，提高食品成分結(jié)合水分能力從而改變水活度。
4.滲透壓微生物的細(xì)胞具有半透膜的性質(zhì)，可以透水，但對于其他物質(zhì)的透過則有選擇性，低滲藥液可使細(xì)胞膜膨脹，但高透藥液可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出而處于脫水狀態(tài)。所以一般微生物在濃鹽溶液或濃糖溶液中不易生長繁殖，就是由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)水分滲出而脫水的緣故。如蔗糖是微生物的良好營養(yǎng);單糖漿含蔗糖85%，為其等滲濃度9.25%的9倍多，卻能保持不長菌;若濃度不夠，容易長菌敗壞。
七、有關(guān)名詞解釋
滅菌系指殺死或除去所有微生物的繁殖體和芽胞，使之完全無菌。
消毒系指僅僅殺滅病原微生物，使之不成為傳染源。
殺菌系指使用化學(xué)藥品或物理因素，對微生物在短時(shí)間內(nèi)起殺滅的作用。
抑菌即抑制微生物繁殖體的生長及其繁殖。
防腐系指防止或抑制微生物生長繁殖的方法。
無菌系指沒有任何活的微生物存在。
八、物理滅菌法
(一)加熱滅菌法
加熱可破壞微生物中酶、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致微生物死亡。加熱滅菌又分干熱滅菌法和濕熱滅菌法。在同一溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。主要是因濕熱滅菌時(shí)，有水分存在，蛋白質(zhì)容易變性。水分又易使微生物膜壁潤濕，濕熱的穿透力比干熱大。
干熱滅菌法常用的有火焰滅菌法與干熱空氣滅菌法兩種。
(二)紫外線滅菌法
是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長是200~300nm，滅菌力最強(qiáng)的波長是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性，同時(shí)空氣受紫外線照射后產(chǎn)生微量臭氧，從而起共同殺菌作用。紫外線進(jìn)行直線傳播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無菌室的空氣及水的滅菌;不適用于藥液的滅菌、固體物質(zhì)深部的滅菌;普通玻璃可吸收紫外線，因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對人體照射過久，會(huì)發(fā)生結(jié)膜炎，紅斑及皮膚燒灼等現(xiàn)象，故一般在人入室前開啟紫外線燈1~2小時(shí)，關(guān)閉后人才進(jìn)入潔凈室。如果必須在人進(jìn)去后仍要開紫外線滅菌，則人的皮膚及眼睛應(yīng)有有效的防護(hù)措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞，離地面2.5~3m為宜。
用紫外線照射滅菌時(shí)要注意下列問題：
1、紫外線的殺菌力，隨使用時(shí)間增加而減退，一般使用時(shí)間達(dá)到額定時(shí)間70%時(shí)應(yīng)更換紫外線燈管，以保證殺菌效果。國產(chǎn)紫外線燈平均壽命一般為2000h。
2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同，殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。
3、紫外線照射通常按相對濕度為60%的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)，室內(nèi)濕度增加時(shí)，照射量應(yīng)相應(yīng)增加。
4、紫外線滅菌效果與照射的時(shí)間長短有關(guān)，這需要通過驗(yàn)證來確定照射時(shí)間。
5、紫外照射燈的安裝形式及高度，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況,參考使用說明決定。
滅菌方法的驗(yàn)證采用生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)，生物指示劑多用枯草芽孢桿菌。
(三)微波滅菌法
微波是指頻率在30~3000MHz之間的電磁波。水可強(qiáng)烈地吸收微波，使其極性分子轉(zhuǎn)動(dòng)，分子間的磨擦而生熱，且升溫迅速，靠熱力而滅菌。在數(shù)十秒至幾分鐘之內(nèi)可達(dá)100～150℃，并全部殺死液體中的微生物，適于水溶性注射液的滅菌。另外，固體藥材飲片及固體制劑(丸劑、散劑、膠囊粉等)也含少量水分，微波能穿透到固體內(nèi)部，由表至里被均勻加熱，而起干燥、滅菌的作用。多用于口服液體制劑的滅菌，有望用于注射液的滅菌。但可能對某些藥品的PH值、含量、顏色有影響。
(四)輻射滅菌法
輻射滅菌是應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細(xì)菌的方法，又稱電離輻射，前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強(qiáng);后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。
九、化學(xué)滅菌法
化學(xué)滅菌法系指用化學(xué)藥品來殺滅微生物的方法。同一種化學(xué)藥品的低濃度時(shí)呈現(xiàn)抑菌作用，而在高濃度時(shí)則能起殺菌作用。其殺菌機(jī)理可能是：能使微生物蛋白質(zhì)變性死亡，或與酶系統(tǒng)結(jié)合影響代謝，或改變膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒劑消毒法和化學(xué)氣體滅菌法等。
(一)消毒劑消毒法
消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學(xué)消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢，能控制一定范圍的無菌狀態(tài)?？蓪⑾緞┡涑蛇m宜濃度，采用噴淋、涂擦或浸泡等方法對物料、環(huán)境、器具等進(jìn)行消毒。常用的化學(xué)消毒劑有0.1%～0.2%苯扎溴銨溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物體表面滅菌。但要注意其濃度不要過高，以防止化學(xué)腐蝕作用。潔凈室的墻面、天花板、門窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺(tái)、車、桌、椅等表面以及人體雙手(手套)在環(huán)境驗(yàn)證及日常生產(chǎn)時(shí)，應(yīng)定期清潔并用消毒劑噴灑，無菌室用的消毒劑必須在層流工作臺(tái)中，用0.22μm的濾膜過濾后方能使用。
(二)化學(xué)氣體滅菌法
系指利用化學(xué)藥品的氣體或產(chǎn)生的蒸汽進(jìn)行殺滅微生物的方法。
1.環(huán)氧乙烷滅菌法
環(huán)氧乙烷滅菌法是利用環(huán)氧乙烷氣體進(jìn)行殺菌的方法。它是一種傳統(tǒng)的滅菌方法，可應(yīng)用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)施、設(shè)備等的滅菌。
環(huán)氧乙烷滅菌系統(tǒng)，主要有下列四項(xiàng)互相制約的重要因素影響滅菌效果：
1、溫度;2、濕度;3、氣體濃度;4、滅菌時(shí)間。
因?yàn)榄h(huán)氧乙烷是易燃易爆物質(zhì)，明火可以引起燃燒，同時(shí)由于氣體分解還可能引起爆炸，環(huán)氧乙烷滅菌中應(yīng)十分注意安全問題。
2.甲醛等蒸汽熏蒸法
采用甲醛、丙二醇或過氧醋酸等化學(xué)品，通過加熱產(chǎn)生蒸汽進(jìn)行空氣環(huán)境滅菌。
(1)、計(jì)算房間體積，按10g/m3的比例稱出甲醛。
(2)、將甲醛倒入甲醛發(fā)生器或加熱盤或燒杯中，并放好加濕用水，必要時(shí)還需加入高錳酸鉀(2~3g/m3)，然后加熱(甲醛發(fā)生器用蒸汽加熱，加熱盤或燒杯用熱水盛入其中加熱)使其蒸發(fā)成氣體。
(3)、滅菌流程：空調(diào)器停止運(yùn)轉(zhuǎn)→啟動(dòng)甲醛氣體發(fā)生器或在加熱盤中加熱甲醛→讓甲醛氣體擴(kuò)散約30分鐘→啟動(dòng)空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)約30分鐘→停止空調(diào)器，房間熏蒸消毒，時(shí)間不少于8小時(shí)→ 房間排氣，用新鮮空氣置換約2小時(shí)→ 恢復(fù)正常運(yùn)行。
當(dāng)相對濕度在65%以上，溫度在24~40℃時(shí)，甲醛氣體的消毒效果最好。
3、臭氧消毒法
臭氧(O3)的消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧(O2)和單個(gè)氧原子(O)，后者具有很強(qiáng)的活性，對細(xì)菌有極強(qiáng)的氧化作用，臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細(xì)胞膜，將其殺死。多余的氧原子則會(huì)自行重新結(jié)合成為普遍氧分子(O2)，不存在任何有害殘留物，故稱為無污染消毒劑。它不但對種種細(xì)菌(包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等)有極強(qiáng)的殺滅能力，而且對霉菌也很有效。
十、無菌操作法
無菌操作室應(yīng)達(dá)到GMP的規(guī)定，為達(dá)無菌的要求可采取綜合措施：
?、賾?yīng)采用層流潔凈空氣技術(shù);
?、诳刹捎眉兹┑日羝舴ㄏ竞妥贤鉄魷缇ㄟM(jìn)行空氣環(huán)境滅菌;
③室內(nèi)用具、墻、桌等暴露面用消毒劑噴、擦消毒;
?、芷渌锲房蔁釅夯蚋蔁岱缇?
?、莶僮魅藛T衣、帽、鞋、手等消毒及滅菌。
無菌操作室應(yīng)定期進(jìn)行菌落檢查。一般采用培養(yǎng)皿暴露20~30min，37℃培養(yǎng)48h，每只培養(yǎng)皿內(nèi)不超過3個(gè)菌落為合格。
十一、食品的防腐與防腐劑
微生物有水分及其他適宜條件就可以繁殖，很多食品易被微生物污染，所以除采用適當(dāng)方式滅菌外，可加防腐劑以抑、殺微生物。
防腐劑，又稱抑菌劑，系指能抑制微生物生長繁殖的物質(zhì)，常用的防腐劑有：
1.苯甲酸與苯甲酸鈉為常用的有效防腐劑，一般用量為0.1%～.25%。苯甲酸水溶性較差，而苯甲酸鈉水溶性好，易溶解，應(yīng)用方便。
2.對羥基苯甲酸酯(尼泊金類)有甲、乙、丙、丁四種酯，抑霉菌作用較強(qiáng)，一般用量為0.01%～0.25%。
3.山梨酸與山梨酸鉀山梨酸的分子結(jié)構(gòu)式為CH3—CH=CH—CH=CH—COOH，常用濃度為0.15%～0.05%。對細(xì)菌和霉菌均有較強(qiáng)抑菌效力。
4.其他含20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中藥中很多揮發(fā)油及0.1脫水醋酸等均有防腐效力。
