一、目的
用于化妝品微生物指標(biāo)（菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)、耐熱大腸菌群、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢測(cè)；
二、參照標(biāo)準(zhǔn)及微生物限量
本方案參照食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)頒布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版和2022版征求意見稿、SN/T 2098-2008 《食品和化妝品中的菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)方法-螺旋平板法》。
三、組成部分
本方案提供化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)所需儀器和培養(yǎng)基及其他試劑。
四、檢測(cè)流程及方案
流程解讀
1.樣品采集
2.樣品前處理
2.1液體樣品：用吸管手動(dòng)吸取或用自動(dòng)重量稀釋儀自動(dòng)稱重稀釋，均質(zhì)器自動(dòng)均質(zhì)后制成1:10檢樣。按需進(jìn)行梯度稀釋。
2.2 油性液體樣品：10g樣品+5mL滅菌石蠟油混勻+10ML滅菌吐溫80
?。?0℃-44℃水浴振蕩10min）+75ML滅菌生理鹽水（40℃-44℃預(yù)溫），乳化后制成1:10的懸液。按需進(jìn)行梯度稀釋。
2.3 膏、霜、乳劑半固體狀樣品
2.3.1 親水性樣品：10g樣品+ 90ML滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min—2min，靜止取上清，上清為1:10勻液。按需進(jìn)行梯度稀釋。
2.3.2 疏水性樣品：10g樣品+10mL 滅菌液體石蠟+10mL 滅菌吐溫 80+70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min—5min，制成1：10 檢液。按需進(jìn)行梯度稀釋。
2.3.3 固體樣品：稱取10g+90mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min—5min，充分均質(zhì)混勻，靜置后，取上清液作為1：10 的檢液。
總結(jié)：化妝品根據(jù)與水分子的親和性及性狀的不同，具有不同的類型，包括疏水性樣品和親水性樣品以及液體樣本和固體樣本，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不同類型的樣品取10g/10mL經(jīng)過不同的前處理，形成1:10的檢液。其中，親水性樣本一般選擇生理鹽水進(jìn)行稀釋，而油性液體樣本或疏水性樣本稀釋液除生理鹽水以外，還需添加一定體積的非離子型表面活性劑（如tuwen80）與液體石蠟混合用于樣品的乳化過程，從而使微生物更均勻的分散，以便于其檢出。此過程一般可通過重量稀釋儀和均質(zhì)器實(shí)現(xiàn)。
3. 樣品接種
根據(jù)化妝品技術(shù)規(guī)范需要傾注法接種樣品，但此法對(duì)操作人員的要求較高，而涂布法操作難度低，可預(yù)先倒置相關(guān)微生物檢測(cè)的培養(yǎng)基平板，用自動(dòng)細(xì)菌涂布儀涂布接種，上樣量可調(diào)至100微升。此外，根據(jù)SN/T 2098-2008 《食品和化妝品中的菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)方法-螺旋平板法》，化妝品中菌落計(jì)數(shù)還可選擇螺旋接種法。
4.樣品培養(yǎng)
細(xì)菌用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，霉菌和酵母菌用霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件根據(jù)微生物種類的不同而不同。
表2 不同微生物指標(biāo)檢測(cè)培養(yǎng)條件
微生物種類 檢測(cè)指標(biāo) | 培養(yǎng)條件 | |
溫度 | 時(shí)間 | |
菌落總數(shù) | 36℃±1℃ | 48h±2h |
耐熱大腸菌群 | 44.5℃±0.5℃/36℃±1℃ | 24h±2h/18h-24h |
銅綠假單胞菌 | 36℃±1℃ | 18h—24h |
金黃色葡萄球菌 | 36℃±1℃ | 24h±2h |
霉菌和酵母菌 | 28℃±2℃ | 5d |
5.樣品檢測(cè)
微生物定量檢測(cè)用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀實(shí)現(xiàn)菌落計(jì)數(shù)，如樣品中菌落總數(shù)的測(cè)定、霉菌及酵母菌總數(shù)；微生物定性檢測(cè)用自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，如銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的定性。
五．產(chǎn)品信息
表3 化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)相關(guān)設(shè)備列表
序號(hào) | 設(shè)備名稱 | 推薦型號(hào) | 推薦品牌 |
1 | 重量稀釋儀 | DW-JURAY | 杭州大微 |
2 | 拍擊式均質(zhì)器 | DW-4 | 杭州大微 |
3 | 微生物試劑自動(dòng)分裝儀 | DW-9 | 杭州大微 |
4 | 全自動(dòng)微生物螺旋接種儀 | DW-L2000 | 杭州大微 |
5 | 自動(dòng)微生物涂布接種儀 | DW-16 | 杭州大微 |
6 | 全自動(dòng)革蘭氏染色儀 | DW-GS100 | 杭州大微 |
7 | 細(xì)菌麥?zhǔn)蠞岫葍x | DW-MF30 | 杭州大微 |
8 | 自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng) | DW-M80 | 杭州大微 |
9 | 全自動(dòng)微生物菌落計(jì)數(shù)儀 | DW-V9 | 杭州大微 |
10 | 恒溫培養(yǎng)箱 | BPMJ-150F | 上海力康 |
11 | 霉菌培養(yǎng)箱 | BPH-9162 | 上海力康 |
12 | 水浴振蕩器 | HTS-10 | 上海赫田 |
表4 化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)相關(guān)培養(yǎng)基
序號(hào) | 檢測(cè)指標(biāo) | 培養(yǎng)基名稱 | 規(guī)格及貨號(hào) | 推薦品牌 |
1 | 細(xì)菌總數(shù) | TTC卵磷脂、吐溫 80 —營(yíng)養(yǎng)瓊脂 | 250g/瓶, HB5189 | 青島海博 |
2 | 耐熱大腸菌群 | 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑） | 250g/瓶， HB8593 | 青島海博 |
3 | 伊紅美蘭（EMB）瓊脂 | 250g/瓶， HB0107 | 青島海博 | |
4 | 胰蛋白胨水 | 250g/瓶， HB5218 | 青島海博 | |
5 | 銅綠假單胞菌 | SCDLP 液體培養(yǎng)基 | 250g/瓶 | 廣東環(huán)凱 |
6 | 十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基 | 9cm*10/包， HBPM5184 | 青島海博 | |
7 | 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 | 250g/瓶， HB0109 | 青島海博 | |
8 | 金黃色葡萄球菌 | SCDLP 液體培養(yǎng)基（見上）或 7.5%氯化鈉肉湯 | 250g/瓶， HB4119 | 青島海博 |
9 | Baird Parker 平板 | 250g/瓶， HB4115 | 青島海博 | |
10 | 亞碲酸鹽卵黃增菌液（Baird Parker 平板添加劑） | 5ml*10 ，HB4116-1 | 青島海博 | |
11 | 霉菌及酵母 | 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 | 250g/瓶，HB0237-2 | 青島海博 |
表5 化妝品微生物指標(biāo)檢測(cè)相關(guān)試劑
序號(hào) | 試劑名稱 | 用途 | 規(guī)格及貨號(hào) | 推薦品牌 |
1 | 氯化鈉 | 樣品前處理稀釋 | 500g/瓶 | 國(guó)藥 |
2 | 吐溫80 | 樣品乳化劑 | 100ml/瓶，9005-65-6 | biosharp |
3 | 無菌液體石蠟 | 樣品前處理 | 1.7ml*20， GS070 | 青島海博 |
4 | Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒 | 耐熱大腸靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn) | 5ml*2/盒；HB8279 | 青島海博 |
5 | 革蘭氏染色液 | 細(xì)菌染色 | 500Ml/瓶，3瓶/套 | 杭州大微 |
