熒光作為生物學(xué)特異性識別的主要手段，一直以來在生命科學(xué)中發(fā)揮著重要作用。但是這需要被分析的物質(zhì)具有熒光或者可以被熒光所標記。
振動光譜(IR & Raman)是成熟無標記的技術(shù)，能夠直接提供物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)信息，能夠為生命科學(xué)提供廣泛的大分子、藥物、材料、脂質(zhì)體等無標記物質(zhì)的表征能力，在生命科學(xué)研究中具備重大潛力。
具有亞微米和同步拉曼能力的O-PTIR克服了傳統(tǒng)紅外顯微鏡分辨率不足和在不平整表面米氏散射嚴重的問題，使得這種廣泛的大分子表征現(xiàn)在可以在<500 nm的生物相關(guān)空間尺度上進行，實現(xiàn)紅外與拉曼和熒光成像分辨率相匹配，具備真正意義上的共定位能力。 現(xiàn)在，mIRage-LS將這些技術(shù)完全集成到一個系統(tǒng)上，僅需一臺設(shè)備即可實現(xiàn)樣品的全面紅外、拉曼、熒光信號分析，獲得任意一種單一技術(shù)本身都無法獲得的額外信息和見解。
產(chǎn)品特點：
☆ 熒光紅外共定位成像分析
☆ 亞微米尺度紅外拉曼分辨率
☆ 紅外拉曼同步測量
☆ 非接觸式測量，同時支持透射、反射模式并且無米氏散射問題
☆ 可測試活細胞(液體環(huán)境)
優(yōu)勢領(lǐng)域：
單細胞分析：
☆ 正常/患病細胞分化
☆ 藥物-細胞相互作用
☆ 細胞內(nèi)(脂滴) 成像研究
組織分析：
☆ 細胞分型
☆ 鈣化、疾病狀態(tài)區(qū)分
☆ 膠原蛋白取向
細菌觀測：
☆ 單細菌鑒定
☆ 細菌代謝研究
光學(xué)光熱紅外O-PTIR在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的顯著優(yōu)勢：
☆ 亞微米級的空間分辨率；
☆ 可直接獲取液體中活細胞的紅外成像；
☆ 靈敏度高，可直接觀測單細胞 (如細菌、哺乳動物細胞等)；
☆ 無米氏散射干擾，即使在細胞邊緣也不受影響；
☆ 超高光譜分辨率；
☆ 無需直接接觸即可測量軟組織的紅外光譜；
☆ 可實現(xiàn)紅外和拉曼同步測量；
☆ 可實現(xiàn)超過10 μm厚的樣品測試，直接置于載玻片上觀察分析；
☆ 可配置極化的紅外光源
超分辨紅外技術(shù)O-PTIR
理想空間分辨率橫向?qū)Ρ?(FTIR, QCL and O-PTIR microscopes)
專為生物樣本設(shè)計的新型“雙區(qū)(C-H/FP)”QCL
新型“雙區(qū)(C-H/FP)”QCL能夠在在一臺設(shè)備中同時涵蓋了C-H拉伸和指紋區(qū) (3000-2700、1800-950cm-1) 反射模式下收集的O-PTIR光譜在數(shù)據(jù)庫(Wiley KnowItAll)搜索結(jié)果，匹配率超過95%。
應(yīng)用案例：
1. 熒光成像與O-PTIR聯(lián)合表征
熒光成像對于分子生物學(xué)機制的研究具有十分重要的意義，而傳統(tǒng)紅外很難原位測量細胞的紅外圖譜，因此無法將蛋白定位與原位細胞的紅外圖譜進行原位疊合，這對于紅外在生物學(xué)的機制研究中的應(yīng)用十分不利。而O-PTIR能夠直接在不損傷細胞的情況下測量不同區(qū)域的紅外圖譜，與熒光圖像相結(jié)合探究蛋白結(jié)構(gòu)與分布上的變化。
圖1. 阿爾茲海默癥腦組織切片樣品，左側(cè)白光圖，中間熒光圖，右側(cè)O-PTIR在中圖中的紅色與藍色區(qū)域的采集的紅外圖譜
2. 感染瘧原蟲的紅細胞表征
瘧原蟲屬寄生蟲引起的瘧疾是威脅生命的主要疾病之一，而瘧原蟲引發(fā)的感染周期十分復(fù)雜，因此在細胞和分子水平觀察瘧原蟲的變化對于研究瘧原蟲的致病有著重要意義。Agnieszka M. Banas等人通過使用O-PTIR對瘧原蟲感染的紅細胞在亞微米尺度的分子特征變化進行了表征，結(jié)果顯示正常紅細胞的蛋白呈現(xiàn)環(huán)狀分布，而感染后的紅細胞蛋白質(zhì)則呈現(xiàn)無規(guī)則分布。通過對比傳統(tǒng)FTIR與基于O-PTIR技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)，O-PTIR能夠提供更為詳細的圖像分辨率并且能夠測量紅細胞不同位置的光譜信息。而傳統(tǒng)FTIR受制于米氏散射限制，效果較差。
圖2. 對比FTIR與O-PTIR對紅細胞成像的結(jié)果：(a)紅細胞的白光圖；(b)圖a中紅色方塊放大的區(qū)域；(c,e)FTIR的蛋白/脂質(zhì)空間分布的紅外成像；(d,f)O-PTIR的蛋白/脂質(zhì)空間分布的紅外成像；(g)紅細胞的FTIR紅外光譜；(h)紅細胞的O-PTIR紅外光譜;(g,i)瘧原蟲感染紅細胞和正常紅細胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分；(h,j)瘧原蟲感染紅細胞和正常紅細胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分
參考文獻：B. [Malaria] “Comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (Nature Communication Chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
3. 單個病毒的紅外成像
受制于紅外極限分辨率的限制，單個病毒的紅外光譜成像一直以來都是十分困難的，對于只有100 nm左右的病毒進行紅外光譜成像顯得十分無力。Yi Zhang等人使用O-PTIR技術(shù)成功實現(xiàn)對單個痘病毒進行了檢測，并成功觀測到了病毒的外形，同時對病毒表面的蛋白的光譜進行了表征。
圖3. 單個痘病毒的光譜和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射圖像；(b)痘病毒1550cm-1波數(shù)下的MIP圖像；(c)痘病毒1650cm-1波數(shù)下的MIP圖像；(d)隨機選取病毒上4個點的光譜
參考文獻：“Vibrational Spectroscopic Detection of a Single Virus by Mid-Infrared Photothermal Microscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
4. 光學(xué)光熱紅外O-PTIR與Raman光譜協(xié)同分析固定或活的單細胞
英國曼徹斯特大學(xué)的Peter Gardner教授近期發(fā)表了他們關(guān)于活(和固定)細胞振動光譜分析的研究結(jié)果。作者使用光學(xué)光熱紅外O-PTIR與Raman光譜，并借助于兩個激發(fā)源（QCL和OPO激光器），對細胞進行了寬光譜范圍的覆蓋，從而使所有與生物學(xué)相關(guān)的分子振動都能被檢測到，且保持一致的亞微米的空間分辨率。此外，紅外光譜采集與拉曼光譜有效的結(jié)合起來，在相同的激發(fā)位置，形成振動互補，得到一套完整的振動光譜信息。如下圖所示，該紅外和拉曼的組合方式可以用來分析液體環(huán)境中固定或活細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)，其中的蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)及富脂體均可以在亞微米尺度上被有效地識別出來。
圖4. O-PTIR觀測固定未染色MIA PaCa-2細胞成像。(a)固定的未染色的MIA PaCa-2細胞的光學(xué)圖像；(b)紅色方塊區(qū)域的放大圖像；(c)OPO波束段的O-PTIR紅外光譜；(d)QCL波束段O-PTIR的紅外光譜；(e)黑色區(qū)域的拉曼和紅外光譜
參考文獻：D. [Mammalian cancer cell] “Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). Advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
5. O-PTIR與S-XRF聯(lián)用探究阿爾茲海默癥
阿爾茲海默癥（AD）是老年癡呆癥常見的病癥之一，而淀粉樣β蛋白沉淀是引發(fā)AD的重要病因之一，因此對于淀粉樣β蛋白分布的研究就顯得十分重要。Nadja Gustavsson等人通過O-PTIR成功觀測到了神經(jīng)中的淀粉樣β蛋白分布，并且結(jié)合S-XRF分析發(fā)現(xiàn)鐵簇與淀粉樣β-折疊結(jié)構(gòu)和氧化的脂質(zhì)存在共定位關(guān)系。這項研究充分預(yù)示了O-PTIR/S-XRF聯(lián)合技術(shù)可在AD疾病的研究中發(fā)揮重要作用。
圖5. 單個神經(jīng)元的O-PTIR與X光熒光成像。（a）單個神經(jīng)元的光學(xué)（左）與O-PTIR圖像（中和右）；（b）神經(jīng)元上銅、鐵的分布；（c）鐵與蛋白疊合圖；（d）鐵與脂質(zhì)的疊合圖
測試數(shù)據(jù)：
單細胞分析
☆ 正常/患病細胞分化
☆ 藥物-細胞相互作用
☆ 細胞內(nèi)(脂滴) 成像研究
細胞內(nèi)的熒光+紅外共定位分析
利用熒光同時觀測細胞結(jié)構(gòu)和細胞中的脂滴分布，研究脂滴在細胞中的共定位分析，提供潛在活體無標記相互作用分析數(shù)據(jù)。
磷脂成像 (2856cm-1(CH2) / 2874cm-1(CH3) 100 nm pixel size. ~5 mins. 熒光染色細胞核（藍色），蛋白（紅色））
活體細胞的組分分布分析
磷脂成像，可觀測活細胞內(nèi)的脂滴的分布并且基本不會受到水的干擾，這是傳統(tǒng)紅外所難以達到的。 (2856cm-1(CH2)/ 2874cm-1(CH3) 100 nm pixel size. ~5 mins.）
固定細胞的組分分布分析
磷脂成像沒可觀測到細胞內(nèi)的脂滴分布情況。 (2856cm-1(CH2)/ 2874cm-1(CH3) 100 nm pixel size. ~5 mins.）
組織分析：
☆ 細胞分型
☆ 鈣化、疾病狀態(tài)區(qū)分
☆ 膠原蛋白取向
組織切片分析觀測
腫瘤組織鈣化分析1050cm-1，傳統(tǒng)的FTIR只有大約12微米的空間分辨率，這往往比實際特征大得多，這就是為什么以前沒有看到如此小的局部鈣化。
細菌觀測
☆ 單細菌鑒定
☆ 細菌代謝研究
紅外拉曼聯(lián)合細菌表征，可以同時觀測到細菌的紅外和拉曼圖譜
