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AlleleID是一款綜合性桌面工具,旨在應對細菌鑒定、病原體檢測或物種鑒定的挑戰(zhàn)。以ClustalW多序列比對為核心,AlleleID可用于設計用于微陣列或?qū)崟rPCR的物種鑒定/跨物種探針,包括SYBR Green、TaqMan MGB、TaqMan probes、Molecular Beacons和實時PCR引物。AlleleID還支持設計用于檢測可變剪接事件的微陣列實驗。
物種鑒定試驗/跨物種試驗/AlleleID鑒定試驗
AlleleID使用ClustalW比對序列并分析保守和物種特異性區(qū)域。然后,您可以使用該程序進行實時PCR引物設計(包括SYBR Green引物設計)和雙標記探針設計(TaqMan probes、TaqMan MGB probes和molecular beacons)。這些測定旨在只檢測混合物中的菌株(菌株檢測)或感興趣的物種。
用于檢測成功的復雜算法
通過避免通過自動解釋BLAST搜索結果發(fā)現(xiàn)的同源區(qū)域來設計高度特異性的寡核苷酸。通過避免模板二級結構來提高實時PCR引物和探針的效率?!癕inimal Set”是該程序中具有的功能之一,可幫助設計少量的allele特異性寡核苷酸引物和雙標記探針。從混合物中識別每個所需的物種/菌株/分類群,從而降低分析成本。對于分類群或跨物種分析中,當組或分類群高度不同時,此功能很有用。對于部分預先設計的、經(jīng)過驗證的引物組,AlleleID可以為其余序列設計兼容的引物和探針,用于物種鑒定或分類特異性分析。
廣泛支持實時或定量PCR檢測和SNP/表達微陣列
AlleleID設計了優(yōu)化的SYBR Green引物、TaqMan probes、TaqMan Minor Groove Binding(MGB)probes、FRET probes或molecular beacons,用于實時定量PCR差異基因表達和SNP基因分型分析。您還可以在一次運行中設計多達一萬個序列的實時PCR引物和雙標記探針,用于制作SNP檢測或表達微陣列。
設計Luminex xMAP檢測
AlleleID為基于Luminex的xMAP技術的懸浮陣列系統(tǒng)設計菌株分化多重分析。如果您正在使用密切相關的生物體,此功能將使您能夠在單個反應容器中運行Allele特異性引物延伸(ASPE)和DHA測定。
用于拷貝數(shù)和突變檢測的多重連接依賴性探針擴增(MLPA)測定
AlleleID是一個為MLPA或MRC Holland引入的多重連接依賴性探針擴增技術設計合成探針的程序,使研究人員能夠在沒有合適的試劑盒時擴展該技術。它是一種快速發(fā)展的高通量遺傳分析方法。它可以檢測外顯子缺失、拷貝數(shù)變化和CpG甲基化模式。它具有成本效益、靈敏、特異性和可重復性。
AlleleID還為PamGene Arrays設計了mRNA特異性、DNA特異性和突變特異性MLPA探針。這將使PamChip用戶能夠設計自己的探針,以使用PamGene的高精度檢測平臺檢測感興趣的基因。結合這兩種技術,只需6小時即可輕松檢測到拷貝數(shù)變化和突變。
AlleleID特點:
用于跨物種和分類特定應用的實時PCR和微陣列引物/探針設計
對于跨物種分析,AlleleID識別保守區(qū)域以設計通用探針。在設計診斷分析時,此功能對于檢測物種或分類群很有用。當所研究的生物體的基因組草圖不可用時,此功能還可用于幫助研究基因表達。
當無法識別一組序列的緊要保守區(qū)域時,AlleleID會嘗試設計“Mismatch Tolerant”probe。probe可以包括至多指定數(shù)量的錯配堿基,這些錯配堿基盡可能靠近5'端。
還包括“Minimal Set”選項,可幫助您設計少數(shù)量的探針組,以識別序列,從而降低總體分析成本。
跨物種檢測
在進化過程中,生物體DNA組成的變化,例如單核苷酸多態(tài)性,導致了表型性狀的多樣性。一代又一代地繼承這些變化并為物種的生物多樣性做出貢獻。盡管發(fā)生了全部這些變化,但仍有一段DNA在進化過程中保持保守。此類保守區(qū)域或序列可用于提示系統(tǒng)發(fā)育相似的群體、識別群體內(nèi)的生物或了解其在特定區(qū)域的植物群中的生物多樣性程度。
現(xiàn)代跨物種檢測技術
實時PCR和微陣列為診斷病原體提供了一種快速、靈敏、特異性和定量的工具。當樣本中存在不止一種病原體時,疾病不輕易根據(jù)癥狀來區(qū)分。顯微鏡鑒定需要在專門的培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)天至數(shù)周。近來,實時PCR檢測已成功用于檢測真菌病原體,如Rhizoctonia, Pythium, and Fusarium。
設計跨物種分析涉及使用多序列比對工具來識別DNA的保守片段,以及設計用于檢測它的雜交探針。近來,使用分子水平鑒定技術(如實時PCR的微陣列)在分類水平上對微生物進行鑒定取得了進展。
AlleleID如何設計跨物種/類群特異性分析
AlleleID設計了實時PCR分析,包括molecular beacons、TaqMan probes、TaqMan MGB和SYBR Green引物,以及用于設計用于分類區(qū)分的通用探針的微陣列。
在設計分類群特異性分析時,AlleleID設計了一個通用探針來識別混合物中的一個分類群或一組生物。當此類設計不可行時,對于具有挑戰(zhàn)性的問題,AlleleID嘗試通過很大限度地減少錯配來進行設計,尤其是在問題較多的 3' 端避免它們。
要設計特定分類/跨物種探針,請對齊序列或加載對齊文件
AlleleID為設計特定分類群/跨物種分析提供了多種設計選項
帶有保守引物的保守探針: AlleleID通過比對序列來識別保守區(qū)域,然后在其中設計探針。這使得能夠用單個探針識別集合中的任意序列。它還在探針兩側(cè)的保守區(qū)域設計引物對。因此,單個引物對可以擴增一個組或一個分類群的全部序列。
類群特異性/跨物種鑒定:具有保守引物的保守探針
類群特異性/跨物種鑒定:具有理想引物的保守探針
Conserved Probe with Optimal Primers: AlleleID設計了一個引物對,可以在比對中擴增盡可能多的序列。設計引物有兩種選擇,Unique和Optimal。對于“Unique”,程序設計了一個引物對來擴增每個序列。每個引物與其模板同源。對于“Optimal”,該程序很大限度地減少了擴增全部序列所需的引物數(shù)量;利用引物可以與序列結合并擴增它的事實,即使它們包含有限的不匹配的堿基,特別是在引物的5'端。
類群特異性/跨物種鑒定:具有不匹配堿基和保守引物的探針
Probes with Mismatched Bases and Conserved/Optimal Primers: AlleleID可以設計具有特定數(shù)量錯配堿基的探針。不匹配的堿基將遵循多數(shù)共識,這意味著探針將具有比對中常見的堿基。這種設計很大限度地降低了成本,這是一個關鍵的考慮因素,尤其是在診斷分析設計中。引物設計在保守區(qū)域。為了降低分析成本,它設計了在比對中擴增保守區(qū)域所需的少量的引物對。
類群特異性/跨物種鑒定:具有不匹配堿基和理想引物的探針
Minimal Probes with Optimal Primers: 當比對序列之間的同源性很低且上述兩種設計(單個分類群特異性探針組或具有錯配耐受性的探針組)都不可行時,AlleleID設計盡可能少的探針以檢測比對中的全部序列。該程序先設計對多數(shù)共識的探針,然后對少數(shù)共識和剩余的單個序列進行探針設計。這種設計很有用,特別是對于研究從不同地理位置獲得的序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關系。
類群特異性/跨物種鑒定:具有錯配堿基和保守引物的探針
類群特異性/跨物種鑒定:具有錯配堿基和理想引物的探針
Minimal Probes with Optimal Primers: 當比對序列之間的同源性很低且上述兩種設計(單個分類群特異性探針組或具有錯配耐受性的探針組)都不可行時,AlleleID設計盡可能少的探針以檢測比對中的全部序列。該程序先設計對多數(shù)共識的探針,然后對少數(shù)共識和剩余的單個序列進行探針設計。這種設計很有用,特別是對于研究從不同地理位置獲得的序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關系。
類群特異性/跨物種鑒定:Minimal Probes with Optimal Primers
Y代表可以識別的序列
物種鑒定
使用AlleleID,您可以設計用于從混合序列中識別物種和菌株的檢測方法
指定序列:通過將它們移動到“Bind”框來指定要在混合中檢測的序列。
引物設計的選擇:引物設計有兩種選擇,Unique和Optimal。當您選擇Unique時,程序會設計一個引物對來擴增每個序列。對于Optimal,該程序很大限度地減少了擴增全部序列所需的引物數(shù)量。目標是小化合成和總體分析成本。
探針設計的選擇:與探針類似,當您選擇Unique時,AlleleID為每個序列設計一個探針。當您選擇Minimal set選項AlleleID設計了識別序列所需的少量的探針。
歷史上如何識別物種
在疾病診斷和藥物開發(fā)領域,用于細菌和物種鑒定的基于培養(yǎng)的方法已被更快、更可靠的基于分子的技術(如實時PCR和微陣列)迅速取代。這些技術成功的原因是人們可以很輕易地從從空氣、土壤或水等復雜來源收集的樣本中識別出一個物種。
基于分析的技術使用針對目標基因的特定區(qū)域設計的物種特異性探針來檢測和鑒定細菌。微陣列可以在復雜的背景下同時快速檢測和識別多種病原體。
現(xiàn)代物種鑒定技術
AlleleID設計了實時PCR分析,包括molecular beacons、TaqMan probes、TaqMan MGB和SYBR Green引物)和用于細菌鑒定、病原體檢測和分類/物種鑒定的微陣列。AlleleID使用快速準確的ClustalW算法來比對序列以識別物種特定區(qū)域。
物種識別:對齊序列并識別特有區(qū)域
AlleleID提供多種物種鑒定選項
Unique Probes with Unique Primers:當選擇的探針類型為Unique時,AlleleID設計探針來識別Bind To框中的每個序列,每個序列一個探針。程序會搜索排列中每個序列所特有的堿基位置。探針的中心盡可能靠近這些Unique的堿基,因此即使錯配只一個堿基,檢測也能成功。
物種鑒定:Unique Probes with Unique Primers
Minimal Set with Unique Primers: 選擇Minimal set選項,AlleleID設計了識別序列所需的少量的探針。Minimal set通常包含比要識別的序列數(shù)量更少的探針,并且探針的特有組合識別每個序列。這種測定的目的是使合成和總體測定成本小化。
物種鑒定:Minimal Set with Unique Primers
A "Minimal Probe" Matrix
Y代表可以識別的序列。
Minimal Probes with Optimal Primers
對于Optimal,該程序很大限度地減少了擴增全部序列所需的引物數(shù)量。目標是小化合成和總體分析成本。
物種鑒定:Minimal probes with Optimal primers
選擇性拼接
DNA微陣列可能是剪接變異研究很有用的技術。AlleleID包括設計用于檢測可變剪接和基因剪接事件的微陣列探針的能力。
AlleleID設計了兩種類型的微陣列探針,我們稱之為junction probes和exon probes,讓用戶可以控制設計參數(shù)。
AlleleID通過為每個接頭和/或創(chuàng)建的每個剪接變體設計探針來檢測可變剪接事件。
AlleleID設計exon probes。這種探針對于確認變體中是否存在exon很關鍵。
基因剪接技術資源。
什么是選擇性剪接?
基因的編碼和非編碼片段可以以不同的方式排列。當這從同一親本基因產(chǎn)生不同的m-RNA序列時,這種現(xiàn)象被稱為可變剪接。這個過程的生物學后果可能很嚴重,因為相同的基因會導致形成不同的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)可能是功能性的、非功能性的或功能障礙的。剪接事件的各種形式被稱為剪接變體。如上所述,AlleleID可用于使用微陣列實驗進行剪接變異檢測。
Exon Junction引物設計
使用AlleleID,您還可以設計across exon junctions的引物。通過解釋GenBank標頭注釋或手動指定它們來識別exon。
為了從cDNA和gDNA的混合物中選擇性地擴增cDNA,設計引物使得一對引物中至少有一個引物across exon junctions。引物設計用于與由其合成的mRNA或cDNA退火,但不與基因組DNA退火。
設計TaqMan Probes
TaqMan Probes:AlleleID設計了理想的TaqMan Probes,不含二聚體、重復和運行,以確保信號保真度。
TaqMan MGB Probes:AlleleID支持TaqMan MGB Probes的設計,與常規(guī)TaqMan Probes相比,該Probes通常更短。
多重和等位基因鑒定分析: AlleleID支持多達四個序列的多重化,避免與全部雙標記探針和引物的交叉同源性,防止多重反應中的競爭。設計用于SNP鑒定的野生和突變TaqMan Probes。
評估預先設計的基于TaqMan Probes的檢測:可以評估預先設計的引物組并設計兼容的TaqMan Probes。同樣,可以評估預先設計的TaqMan Probes并設計兼容的引物。您甚至可以導入在SYBR Green引物設計模式中設計的引物,然后設計兼容的探針。
圖形視圖:顯示TaqMan Probes二級結構的圖形視圖。
排名:使用統(tǒng)計優(yōu)化技術,只為每個模板設計好的TaqMan Probes。
SYBR? Green Assays的引物設計
設計引物:設計針對SYBR Green分析優(yōu)化的引物。
避免同源性: AlleleID通過BLAST搜索您的序列來進行高特異性的SYBR Green引物設計,自動解釋結果,然后設計高特異性的SYBR Green引物。
BLAST: SYBR Green引物可以針對NCBI提供的基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST。這有助于驗證SYBR Green引物設計并可視化引物和擴增子的特異性。
模板二級結構:在設計SYBR Green引物時避免識別模板結構。
算法:使用nearest neighbor熱力學算法計算SYBR Green Primer Tm。
SYBR Green Primer Rating:根據(jù)預期的引物效率對設計的SYBR Green引物進行排名。
綜合標準:篩選SYBR Green引物的熱力學特性、位置和二級結構。
多重引物:避免與全部其他二聚體的交叉同源性以減少引物二聚體。
預先設計的引物:設計理想的TaqMan Probes和molecular beacons,并與經(jīng)過充分驗證的SYBR Green引物一起使用。此外,您可以使用預先設計或已發(fā)表或經(jīng)過充分驗證的正向或反向引物,并讓AlleleID設計其余的分析。例如,對于給定的正向引物,AlleleID將為SYBR Green檢測設計反向引物,并為TaqMan檢測設計反向引物和TaqMan Probes。
SNP擴增:設計SYBR Green引物以擴增SNP位點。AlleleID甚至可以分析SNP特異性引物,以幫助您確定它們對反應的適用性。
Molecular Beacon設計
Tm調(diào)整:自動選擇適當長度的桿以獲得理想信標Tm。
Optimal Beacons:設計沒有二聚體、重復和運行的信標,以提高信號強度。
多重信標和引物:檢查分子信標與全部引物的交叉同源性,防止多重反應中的競爭。
等位基因鑒定:設計用于檢測野生和突變等位基因的分子信標。
Tm計算:高精度hairpin Tm計算。
評估預先設計的分子信標檢測:可以評估預先設計的引物組或構建預先設計的分子探針的引物。類似地,可以評估預先設計的信標或可以為預先設計的引物組設計信標。這有助于將SYBR Green引物用于信標測定,可用于細菌鑒定測定或任意其他測定。
閃電般的快速:在一秒鐘內(nèi)處理平均cDNA序列。
圖形視圖:以圖形方式顯示設計的信標及其屬性。
FRET Probe設計
Optimal FRET Probes: 設計不含二聚體、重復和運行的Optimal FRET Probes,以確保信號保真度。
等位基因鑒定: AlleleID設計了用于檢測野生和突變等位基因的FRET Probes。
評估預先設計的FRET分析:可以評估預先設計的引物組或構建預先設計的探針的引物。您甚至可以導入在SYBR Green引物設計模式中設計的引物。
圖形視圖:以圖形方式顯示設計的FRET probe及其屬性。
高通量微陣列探針設計
寡核苷酸設計: AlleleID設計用于SNP基因分型和表達研究的高度特異性寡核苷酸微陣列。
cDNA微陣列設計: AlleleID使用優(yōu)化的設計參數(shù),幫助設計用于中等到大型擴增子的引物。
SNP檢測:設計用于雜交和引物延伸檢測的SNP probes。
多個probes:設計每個序列的best probe或每個序列的多個probes,以提高檢測的準確性。
數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)管理
項目:允許創(chuàng)建多個項目。通過為每個實驗創(chuàng)建單獨的項目,可以在AlleleID中輕松組織和管理大量數(shù)據(jù)。
內(nèi)置數(shù)據(jù)庫: AlleleID為序列信息和搜索結果維護一個本地數(shù)據(jù)庫。
數(shù)據(jù)導出: AlleleID以制表符分隔格式導出數(shù)據(jù),以便輕松加載到電子表格和數(shù)據(jù)庫中。
輸入輸出
生成報告:您可以為使用AlleleID設計的分析創(chuàng)建格式精美的報告。它應該有助于記錄保存和與同事共享信息。該報告有助于可視化引物和探針在序列上的位置,包括替代引物和探針的列表,顯示引物、探針、擴增子和序列屬性以及使用的設計參數(shù)。
序列詳細信息視圖:項目中全部序列的綜合信息可使用內(nèi)置數(shù)據(jù)庫在本地獲得,并且可以使用瀏覽器從程序內(nèi)查看序列詳細信息。
序列可視化: AlleleID以圖形方式顯示序列上的引物和探針。
輸入格式:支持標準GenBank和FASTA格式的序列。使用多重檢索工具,可以從本地驅(qū)動器加載序列。
SNP加載:從標準GenBank變異文件中的變異描述符輕松加載數(shù)千個SNP。
在電子表格中查看輸出:可以在任意電子表格(如MS Excel、Lotus 123或StarSuite電子表格)中查看和處理結果。
系統(tǒng)要求:
| 對于Windows | 需要 | 推薦 |
| CPU | Pentium IV 1.80 GHz | Intel Core i3 (3rdGen) |
| 內(nèi)存 | 1GB可用RAM | 2GB或更高的可用RAM |
| 硬盤空間 | 500MB可用硬盤 | 1GB可用硬盤 |
| 屏幕分辨率 | 800×600 | 1024×768 |
Windows支持的平臺:XP/Vista/Windows 7/Windows 8/Windows 10