細(xì)胞死亡的相關(guān)研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點。依據(jù)發(fā)生機(jī)制的不同 (起始的刺激、中間過程的激活和末端的效應(yīng)器的不同) ，細(xì)胞的死亡可以區(qū)分為不同的方式，常見的有細(xì)胞凋亡、焦亡、壞死、鐵死亡等。
圖 1. 不同死亡方式的比較
"鐵死亡"的相關(guān)研究更是近幾年熱點中的“熱點“，這也證明了金屬元素在細(xì)胞死亡中的獨特作用。迎來鐵死亡，又遇銅死亡。
今年 3 月題為 Copper induced cell death by targeting lipoylated TCA cycle protein一文提出：生物體內(nèi)不可缺少的微量元素—銅在其濃度超過了維持穩(wěn)態(tài)機(jī)制的閾值時也會表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。這種現(xiàn)象與鐵積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡的情況有相似之處 (但機(jī)制明顯區(qū)別于鐵死亡)。研究人員將這種銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制命名為 “銅死亡” (Cuproptosis)。
■ 銅死亡的簡要機(jī)制
銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡:當(dāng)Cu2+ 在依賴線粒體呼吸的細(xì)胞中過度積累 (Cu2+ 通過銅離子載體運入細(xì)胞)，Cu2+ 與硫辛?；?DLAT結(jié)合，誘導(dǎo) DLAT 的異聚化。不溶性 DLAT 的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
注：蛋白質(zhì)硫辛?；揎検且环N保守的賴氨酸翻譯后修飾，只發(fā)生在涉及 TCA 循環(huán)的四種蛋白，其中就包括 DLAT。DLAT 是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體 (PDH Complex) 組分之一，丙酮酸脫氫酶可催化 TCA 循環(huán)中的丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶 A。
FDX1 (一種還原酶、Elesclomol 的直接靶標(biāo)) 作為蛋白質(zhì)硫辛?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)因子，一方面，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(包括 DLAT) 的硫辛?；?。另一方面，F(xiàn)DX1 將 Cu2+ 還原成更具毒性的 Cu+，導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白合成的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡: 銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運蛋白 SLC31A1、ATP7A/B、SLC31A1，SLC31A1 負(fù)責(zé)攝入銅，ATP7A 和 ATP7B 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)出銅。銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機(jī)制一致。
圖 2. 銅死亡機(jī)制圖[1]
■ 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
在這篇文章中，研究人員測試了 1448 個銅離子載體 (一種高度親脂性的 Cu2+ 結(jié)合分子，可將銅離子送入細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)對 489 個細(xì)胞系的細(xì)胞殺傷作用 (圖 3A)。以 Elesclomol(一種高度親脂性的 Cu2+ 載體) 為例，單獨加入 Elesclomol 不影響細(xì)胞的生長，同時加入銅離子，細(xì)胞生長就會受到極大抑制，而其他金屬離子 (鐵、鈷、鋅和鎳等) 并不會影響細(xì)胞的生長 (圖 3B)。使用 NSC-319726，Disulfiram等其它銅離子載體處理細(xì)胞也得到了相同的結(jié)果 (圖 3D-E)。
但使用 Tetrathiomolybdate (TTM；一種銅螯合劑) 聯(lián)合 Elesclomol 處理細(xì)胞，可以緩解 Elesclomol 對細(xì)胞的殺傷作用。這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要依賴于細(xì)胞內(nèi)銅的積累。
圖 3. 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡對銅具有高度選擇性[2]
A：1448 個銅離子載體對 489 個細(xì)胞系的生長抑制；B：不同金屬離子的情況下，用 Elesclomol 處理 MON 細(xì)胞；C：其他銅離子載體條件的細(xì)胞活力測定 D：使用 TTM 預(yù)處理 ABC1 細(xì)胞，然后 Elesclomol 處理
■ 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是非凋亡性的
有研究表明 Elesclomol 誘導(dǎo)活性氧依賴性細(xì)胞凋亡，但實驗結(jié)果表明 Elesclomol 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不涉及 Caspase 3 (細(xì)胞凋亡的標(biāo)志) 的切割或激活 (圖 4D-E)。并且當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子 BAX 和 BAK1 被敲除時，以及用 Caspase 抑制劑 (Z-VAD-FMK 和 Boc-D-FMK) 處理細(xì)胞，Elesclomol 仍然維持對細(xì)胞的殺傷潛力，此外，其他已知細(xì)胞死亡機(jī)制的抑制劑處理細(xì)胞 (包括鐵死亡 (Ferrostatin-1)、壞死性凋亡 (Necrostatin-1) 和氧化應(yīng)激 (N-acetylcysteine) )，也都未能消除銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制與細(xì)胞凋亡途徑不同。
圖 4. 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡不通過凋亡[2]
A：ICP-MS 檢測細(xì)胞內(nèi)的銅離子和鋅離子；B：ES-Cu 處理 細(xì)胞，檢測 Caspase 3/7 的激活；C：檢測 Caspase 3 的表達(dá)；F：用 Elesclomol-CuCl2 處理 KO 細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；
■ 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡研究人員觀察到主要依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對銅離子的敏感性更高 (圖 5A)。用線粒體抗氧化劑、脂肪酸和線粒體功能抑制劑等線粒體呼吸途徑相關(guān)的抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：電子傳遞鏈復(fù)合物的抑制劑和線粒體丙酮酸攝取抑制劑 (UK5099) 處理的條件下，銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受抑制，鐵死亡抑制劑的處理對其沒有影響 (GPX4 抑制劑 ML162) (圖 5B)。此外，線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑 FCCP處理對銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有影響。這些結(jié)果表明線粒體呼吸途徑是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必要條件。研究人員還對比了缺氧條件刺激以及 FG-4592激活缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 途徑，發(fā)現(xiàn)只有真實缺氧條件會降低細(xì)胞對銅離子載體的敏感性 (圖 5D)，進(jìn)一步確認(rèn)了線粒體呼吸在銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用。隨后，研究人員分析銅離子處理對細(xì)胞耗氧率 (OCR) 的影響，結(jié)果顯示 Elesclomol 的處理會影響細(xì)胞的最大耗氧量 (圖 5E)。這表明銅離子可能不直接影響電子傳遞鏈，而是影響三羧酸循環(huán) (TCA)。
圖 5. 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[2]A-B：葡萄糖或半乳糖的條件下，檢測細(xì)胞活力；B：Elesclomol 等處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；C：FCCP 預(yù)處理細(xì)胞后用 Elesclomol 處理，檢測細(xì)胞活力；D：對照組 (21% O2)、缺氧的條件 (1% O2) 或 FG-4592 (21% O2) 條件下檢測細(xì)胞活力；E：細(xì)胞耗氧率檢測
■ FDX1 和蛋白硫辛?；倾~細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者
為進(jìn)一步闡明銅離子和 TCA 循環(huán)之間的聯(lián)系。研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體 (Elesclomol-copper) 處理細(xì)胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 7 個基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用 (圖 6A-C)，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途徑的三個關(guān)鍵酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的三個組分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細(xì)胞毒性(圖 6D-E)，研究人員猜測 FDX1 有可能是蛋白質(zhì)硫辛?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)因子。
圖 6. FDX1 和硫辛酸途徑相關(guān)基因是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)[2]A：敲除了不同基因后，細(xì)胞參與銅離子載體誘導(dǎo)的死亡的基因 B：硫辛酸通路的示意圖；C-E：敲除 ABC1 細(xì)胞的 FDX1 和 LIAS 基因，用 Elesclomol 處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力。
為進(jìn)一步驗證這個假設(shè)，研究人員通過資源庫 Cancer Dependency Map，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛酸途徑相關(guān)蛋白在銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面是高度相關(guān)的 (圖 7A)。隨后，研究人員選取腫瘤樣本，對 FDX1 和硫辛?；鞍走M(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛?；鞍妆磉_(dá)顯著相關(guān) (圖 7B-C)。敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白和 DLST 蛋白的硫辛?；笔?(圖 7D)，還會導(dǎo)致細(xì)胞呼吸水平下降 (圖 7E)。
此外，研究人員通過代謝物分析發(fā)現(xiàn)敲除 FDX1 會導(dǎo)致丙酮酸和 α-酮戊二酸積累和琥珀酸的的消耗。還觀察到 LIAS 的關(guān)鍵底物 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的積累。這些結(jié)果表明 FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛酰化的上游調(diào)節(jié)劑(圖 7F)。
圖 7. FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛?；纳嫌握{(diào)節(jié)器[2]A：FDX1 敲除的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)；B-C：腫瘤樣本的 FDX1 和硫辛酸的免疫組化染色；D：敲除 FDX1，檢測硫辛?；鞍椎谋磉_(dá)量；E：敲除 FDX1 基因，檢測細(xì)胞耗氧率；F：敲除 FDX1，檢測與硫辛酰化途徑相關(guān)的代謝物的變化。
■ 銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛?；?DLAT 的寡聚化有研究報道銅離子與游離脂酸的離解常數(shù)為 10–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛?；鞍捉Y(jié)合。為了驗證這一猜想，研究人員純化了 DLAT 和 DLST 蛋白，發(fā)現(xiàn) DLAT 和 DLST 都可以與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 (圖 8A)。而敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白的硫辛?；揎椣В?DLAT 和 DLST 也不再與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 (圖 8B)。這表明蛋白質(zhì)的硫辛?；揎検墙Y(jié)合銅的必要條件。此外，銅與硫辛?；鞍?DLAT 的結(jié)合，會導(dǎo)致蛋白的寡聚化。而 Elesclomol 處理會增加 DLAT 蛋白的寡聚化 (圖 8C-D)。上述結(jié)果表明：在銅離子載體處理后硫辛?；鞍椎亩拘允怯伤鼈儺惓５墓丫圩饔媒閷?dǎo)的。此外質(zhì)譜分析還發(fā)現(xiàn)銅離子載體處理會導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的水平降低 (圖 8E)，這整個過程都依賴于 FDX1 蛋白的存在。
圖 8. 銅直接結(jié)合硫辛酰化的 DLAT 并誘導(dǎo)其寡聚化[2]A：細(xì)胞提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合；B：FDX1 敲除細(xì)胞中提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合；C：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化；D: 免疫熒光共定位分析 E: Mass 分析
■ 銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運蛋白 (圖 9A)。為了進(jìn)一步驗證與銅離子載體介導(dǎo)的死亡與自然狀態(tài)下的銅紊亂的機(jī)制是否相同，研究人員過表達(dá) SLC31A1(圖 9B)。另外，過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞被銅離子載體處理后蛋白硫辛?；瘻p少，F(xiàn)e-S 簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高 (圖 9C)。在過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞中使用鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑不影響銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，銅螯合劑卻可緩解銅離子載體產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用 (圖 9D)。老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b−/−，銅失調(diào)綜合征 Wilson’s disease 模型) 與雜合子 (Atpb7b+/−) 和野生型對照小鼠對比，發(fā)現(xiàn) ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛酰化水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加 (圖 9F)。多種模型證明銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是同一種機(jī)制。
圖 9. 化學(xué)和基因誘導(dǎo)的銅依賴的細(xì)胞死亡之間具有共同的機(jī)制性[2A：銅穩(wěn)態(tài)示意圖；B-C：過表達(dá)SLC31A1，CuCl2 處理細(xì)胞；D：用 Nec-1 等處理過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞，加入 CuCl2，檢測細(xì)胞活力；E：FDX1 KO 細(xì)胞中過表達(dá) SLC31A1，加入 CuCl2 處理后檢測細(xì)胞的活力；F：檢測 Atpb7b-/-小鼠與對照組肝臟的蛋白質(zhì)含量
總結(jié)：這項研究通過利用多種死亡方式的誘導(dǎo)劑與抑制劑從多維度闡明了銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種新型細(xì)胞死亡即銅死亡。研究人員發(fā)現(xiàn)銅離子積累主要通過調(diào)控 FDX1 來介導(dǎo)銅死亡。一方面，F(xiàn)DX1 將 Cu2+ 還原成更具毒性的 Cu+，可促使 TCA 循環(huán)中硫辛?；鞍桩惓９丫刍?，另一方面，F(xiàn)DX1 導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的不穩(wěn)定。
相關(guān)產(chǎn)品
ML162 是一種共價谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 抑制劑。ML162 對表達(dá)突變 RAS 癌基因的細(xì)胞系具有選擇性的致死作用。
FCCP 是線粒體中氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯(lián)劑。
Ferrostatin-1 是一種選擇性的 ferroptosis 抑制劑，抑制 Erastin 誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。
DL-Buthionine-(S,R)-sulfoximine
DL-Buthionine-(S,R)-sulfoximine (BSO) 是谷氨酰半胱氨酸合成酶生物合成的有效抑制劑。
DPQ 是一種有效的 PARP-1 抑制劑，可降低 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 誘導(dǎo)的 PARP 激活。
Elesclomol (STA-4783) 是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Elesclomol 還是一種高度親脂性的 Cu2+ 結(jié)合分子，可用于 Menkes 和遺傳性銅缺乏癥相關(guān)疾病的研究。
Boc-D-FMK 是不可逆的泛半胱天冬酶 (Caspase) 抑制劑，還可以抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
Roxadustat (FG-4592) 是一種低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶 (HIF-PHI) 抑制劑。
Etoposide 抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶 II (topoisomerase-II)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)凋亡和自噬。
UK-5099 (PF-1005023) 是線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運蛋白 (MPC) 的有效抑制劑，抑制丙酮酸依賴性 O2消耗。
Necrostatin-1 (Nec-1) 是一種有效的壞死性凋亡抑制劑。
Z-VAD-FMK 是一種泛半胱天冬酶 (Caspase) 抑制劑。
NSC319726 是突變型 p53R175 再活化劑，能抑制表達(dá) p53R175 的成纖維細(xì)胞增殖，對野生型 p53 細(xì)胞無抑制作用。
Paclitaxel 可穩(wěn)定微管蛋白的聚合，可導(dǎo)致有絲分裂停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
Acetylcysteine (N-acetylcysteine) 是一種活性氧抑制劑。Acetylcysteine 是半胱氨酸前體，通過中和花生四烯酸依賴的 5-脂氧合酶活性所產(chǎn)生的毒性脂質(zhì)來防止血紅素誘導(dǎo)的鐵中毒。
Disulfiram 是特異性的 ALDH1 抑制劑。Disulfiram 有效抑制人體和小鼠細(xì)胞中脂質(zhì)體中的 GSDMD 孔形成，炎性體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和 IL-1β 分泌。
8-Hydroxyquinoline (8-HQ) 是單質(zhì)子二齒螯合劑，可用作防腐劑，消毒劑和殺蟲劑，用作轉(zhuǎn)錄抑制劑。
Pyrithione 是一種鋅離子載體，可引起哺乳動物細(xì)胞內(nèi)鋅水平的升高。Pyrithione 具有有效的殺菌和抗真菌活性。
Rotenone 是線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I抑制劑。Rotenone 通過促進(jìn)線粒體活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
Oligomycin 是一種抗真菌抗生素，是 H+-ATP 合成酶的抑制劑。Oligomycin 阻斷氧化磷酸化和電子傳遞鏈。
Pepstatin (Pepstatin A) 是由放線菌類產(chǎn)生的一種特異性的天冬氨酸蛋白酶抑制劑。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。
參考文獻(xiàn)
1. Yongqiang Wang, Long Zhang, Fangfang Zhou. Cuproptosis: a new form of programmed cell death. Cell Mol Immunol. 2022 Apr 22.
2. Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375(6586):1254-1261.
3. Li SR, Bu LL, Cai L. Cuproptosis: lipoylated TCA cycle proteins-mediated novel cell death pathway. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):158.
4. Tang D, Chen X, Kroemer G. Cuproptosis: a copper-triggered modality of mitochondrial cell death. Cell Res. 2022;32(5):417-418.
