鐵死亡是一種鐵依賴性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬的細(xì)胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 方式，依賴于鐵介導(dǎo)的氧化損傷，鐵積累的增加，自由基的產(chǎn)生，脂肪酸供應(yīng)與脂質(zhì)過氧化物增加是誘導(dǎo)鐵死亡的關(guān)鍵。
鐵死亡的調(diào)控機(jī)制
關(guān)于鐵死亡的調(diào)控，主要受 GSH/GPX4 途徑的調(diào)節(jié)；鐵代謝以及脂質(zhì)代謝的相關(guān)通路也發(fā)揮著重要作用。
關(guān)于 GSH/GPX4 途徑
圖 1. GPX4 相關(guān)信號(hào)通路[1]
System Xc- 是一種廣泛分布在磷脂雙分子層中的重要的抗氧化體系，由兩個(gè)亞基 SLC7A11 和 SLC3A2 組成的異二聚體。胱氨酸和谷氨酸通過 Xc-系統(tǒng) 以 1:1 的比例進(jìn)出細(xì)胞交換，被吸收的胱氨酸 (Cystine) 在細(xì)胞中被還原為半胱氨酸(Cysteine)，并參與 GSH 的合成。
GPX4 是催化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中磷脂氫過氧化物 (PLOOH) 還原的主要酶。GPX4 將谷胱甘肽 (GSH) 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并將細(xì)胞毒性脂質(zhì)過氧化物 (PL-OOH) 還原為相應(yīng)的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累。GPX4 表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞對(duì)鐵死亡更敏感，而 GPX4 表達(dá)上調(diào)則抑制鐵死亡。GSH 在谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX) 的作用下減少 ROS 和活性氮。
此外，甲羥戊酸 (MVA) 途徑通過調(diào)節(jié)硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟來影響 GPX4 的合成，從而調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生。
小貼士：Erastin作為最經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑，可抑制胱氨酸輸入，影響 GSH 的合成，導(dǎo)致 GPX 活性降低，細(xì)胞抗氧化能力下降，脂質(zhì) ROS 積累，最終發(fā)生氧化損傷和鐵死亡。
常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3直接作用于 GPX4 并抑制其活性，從而降低細(xì)胞的抗氧化能力并積累 ROS，導(dǎo)致鐵死亡。
脂質(zhì)過氧化與鐵的積累
圖 2. 脂代謝與鐵死亡相關(guān)通路[2]
鐵依賴性脂質(zhì) ROS 積累與所有途徑的鐵死亡有關(guān)。不受限制的脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標(biāo)志。
游離多不飽和脂肪酸是合成脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)的底物，但它們必須被酯化成膜磷脂并被氧化才能傳遞鐵死亡信號(hào)。脂氧合酶 (LOX) 和細(xì)胞色素 P450 氧化還原酶 (POR) 通過脂質(zhì)的雙氧合啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化。研究表明，磷脂酰乙醇胺是誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵磷脂。?；o酶 A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶 3 (LPCAT3) 參與磷脂酰乙醇胺的生物合成和重構(gòu)，激活多不飽和脂肪酸并影響其跨膜特性。因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物底物的積累，從而抑制鐵死亡。
鐵積累 (如增加鐵吸收、減少鐵儲(chǔ)存和限制鐵外流)可以促進(jìn)鐵死亡 (具體可見: 鐵死亡是什么，如何檢測(cè)？您要的“一文通”來了！)。過量的鐵通過至少兩種機(jī)制促進(jìn)隨后的脂質(zhì)過氧化：通過鐵依賴性 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧 (ROS) 以及激活含鐵酶。
鐵死亡如何檢測(cè)呢？
鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)
鐵死亡是由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的，因此在鐵死亡期間檢測(cè)這種脂質(zhì)過氧化是必要的。此外，線粒體在鐵死亡期間通常表現(xiàn)出萎縮、致密的形態(tài)（因此可以通過檢測(cè)線粒體來判斷鐵死亡)。此外，檢測(cè)特定的基因表達(dá)變化：例如鐵死亡的細(xì)胞中 TfR1 的上調(diào)及其重定位于質(zhì)膜。下面小 M 來給大家介紹幾種常用的鐵死亡檢測(cè)方式~
最常見的細(xì)胞表型檢測(cè)
鐵死亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此一般在鐵死亡的研究中，檢測(cè)細(xì)胞活力是常見方法，同時(shí)也會(huì)通過染色等方法來觀察細(xì)胞膜通透性，線粒體形態(tài)等。
如在Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制 Frataxin (FXN) 是否會(huì)促進(jìn)鐵死亡。用 Erastin 同時(shí)處理 FXN 敲低和對(duì)照細(xì)胞，12 小時(shí)后用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明抑制 FXN 表達(dá)顯著增強(qiáng)了 Erastin 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同時(shí)碘化丙啶(PI) 和 CFDA-SE染色結(jié)果以及用透射電鏡觀察到的線粒體碎裂、空泡化和嵴增大都表明 FXN 耗竭協(xié)同 Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡[3]。
圖 3. 抑制 FXN 對(duì) Erastin 誘導(dǎo)的 HT-1080 細(xì)胞鐵死亡的影響[3]
A, 細(xì)胞暴露于不同濃度的 Erastin，檢測(cè)細(xì)胞活力；B, Erastin 處理細(xì)胞 12 小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察 PI 陽性細(xì)胞；C, Erastin 培養(yǎng)細(xì)胞 3 天，用 CFDA-SE (5 μM) 染色，然后進(jìn)行流式檢測(cè)；D, 透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測(cè)線粒體的形態(tài)變化
亞鐵離子的檢測(cè)
細(xì)胞鐵積累是鐵死亡的典型標(biāo)志之一，亞鐵離子積累可以特異性地增加氧化應(yīng)激水平。例如，在研究氧化應(yīng)激介導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE) 變性的潛在機(jī)制時(shí)，通過用 FerroOrange 染色細(xì)胞 (亞鐵離子探針)，結(jié)果表明 NaIO3和 Erastin 處理的細(xì)胞積累了過多的亞鐵離子，說明誘導(dǎo)了鐵死亡，而 Fer-1或 DFO 預(yù)孵育可以抑制亞鐵離子的積累，如圖 4 所示。結(jié)果表明鐵死亡是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的 RPE 變性的主要病理過程[5]。
圖 4. 通過 FerroOrange 染色評(píng)估亞鐵離子水平[4]
活性氧 (ROS) 檢測(cè)
ROS 和脂質(zhì) ROS 在鐵死亡中起關(guān)鍵作用，文獻(xiàn)報(bào)道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制體內(nèi)的 ROS 水平。細(xì)胞內(nèi)會(huì)由于鐵的積累而抑制抗氧化系統(tǒng)，鐵可能直接通過 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生過量的 ROS，從而增加氧化損傷。因此 ROS 檢測(cè)也是常用方法 (活性氧檢測(cè)探針:ROS 探針大賽，你要的檢測(cè)方法都在這里！)
Lin Li 在研究中發(fā)現(xiàn)羧基修飾的聚苯乙烯納米粒子 (CPS) 可以增加細(xì)胞內(nèi) SOD 水平，因此推測(cè) CPS 可能抑制鐵死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPS 抑制了 RAW 264.7 中 Erastin 誘導(dǎo)的 ROS 升高 (圖 5a, b)，并且比去鐵胺具有更強(qiáng)的抗鐵死亡作用 (圖 5c, d)[5]。
圖 5. CPS 有效抑制 RAW 264.7 細(xì)胞的鐵死亡[5]
A-B, 在有無 CPS 條件下 Erastin 對(duì) ROS 水平的影響；C-D, 在有無 CPS 或 DFO 條件下Erastin 對(duì)細(xì)胞活力的影響
脂質(zhì)過氧化
除了 ROS 檢測(cè)，鐵死亡的脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)還有谷胱甘肽 (GSH) 合成的變化、脂質(zhì)過氧化物 (MDA, LPO) 水平的變化。
在遺傳性血色素沉著癥 (HH，一種鐵超負(fù)荷疾病) 與鐵死亡的關(guān)系研究中，為了證實(shí)鐵死亡在 HH 相關(guān)肝損傷中的作用，作者用鐵死亡抑制劑 Fer-1 治療 Hjv–/–小鼠 (經(jīng)典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 樣小鼠模型) 三周。如圖 6 所示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng) Fer-1 處理的小鼠肝臟 MDA 水平顯著降低，NADPH 水平增加。此外，F(xiàn)er-1 可以降低小鼠血清 ALT 水平膠原蛋白沉積。結(jié)果表明，鐵超載會(huì)誘導(dǎo) HH 小鼠的鐵死亡[6]。
圖 6. 鐵死亡抑制劑 Fer-1 可減輕 HH 小鼠中鐵過載引起的肝損傷[6]
用或不用 Fer-1 治療的野生型、Hjv–/–、Smad4Flox/flox和 Smad4Alb/Alb 小鼠中, A, 肝臟 MDA 含量；B, 肝臟 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝臟 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平
谷胱甘肽代謝
在 DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase一文中，作者探究了 DJ-1 負(fù)調(diào)節(jié)鐵死亡的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，用 RNA 干擾抑制 DJ-1 表達(dá)可以與 Erastin 協(xié)同抑制細(xì)胞內(nèi) GSH 水平 (圖 7A)。同時(shí)，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆轉(zhuǎn) Erastin 誘導(dǎo)的脂質(zhì) ROS 積累 (圖 7B) 和細(xì)胞死亡 (圖 7C)。因此，作者推測(cè) DJ-1 可能會(huì)影響 GSH 的合成從而抑制鐵死亡[7]。
圖 7. DJ-1 通過抑制 GSH 水平負(fù)調(diào)節(jié)鐵死亡[7]
A, Erastin 處理DJ-1 KD H1299 細(xì)胞 6 h 后 GSH 水平；
B, 在有無 GSH 或 NAC 條件下細(xì)胞用 Erastin 處理細(xì)胞 12 h 后脂質(zhì) ROS 水平；C, 用Erastin 處理細(xì)胞 36 h 后，測(cè)定細(xì)胞活力
總結(jié)：
鐵死亡受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，既包括鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)通路,更有鐵代謝以及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路等。
但是各個(gè)通路相輔相成，互相影響。調(diào)控途徑不同， 檢測(cè)的指標(biāo)也十分多樣化，小伙伴們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中，檢測(cè)方法可要多打 “組合拳”！
相關(guān)產(chǎn)品
鐵死亡誘導(dǎo)劑，結(jié)合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。
鐵死亡誘導(dǎo)劑，可直接降低 GPX4 的表達(dá)。
一種氨基酸，在細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，胱氨酸耗竭會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡。
選擇性的鐵死亡抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過還原機(jī)制來防止膜脂的損傷，從而抑制細(xì)胞死亡。
CCK8試劑盒
細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速、高靈敏度試劑盒。
可用于細(xì)胞增殖，活性毒性的檢測(cè)。
可滲透細(xì)胞的，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS) 水平的探針。
用于測(cè)量線粒體膜電位的熒光探針試劑盒。
親脂性紅色熒光染料，可用于線粒體膜電位檢測(cè)。
收集了 500+ 種文獻(xiàn)報(bào)道的具有誘導(dǎo)或抑制鐵死亡相關(guān)的化合物及與鐵死亡密切相關(guān)的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化合物，可以用于鐵死亡機(jī)制及相關(guān)疾病的研究。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
參考文獻(xiàn)
1. Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.
2. Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296.
3. Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483.
4. Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971.
5. Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465.
6. Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792.
7. Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.
