測(cè)量外泌體的粒徑分布一直以來(lái)都是外泌體表征的重要組成部分。但是由于外泌體的尺寸僅為30~200 nm，所以必須借助一些特殊的檢測(cè)手段才能夠?qū)@種在光學(xué)顯微鏡下不可視的顆粒進(jìn)行觀測(cè)。本篇就外泌體粒徑測(cè)量技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行簡(jiǎn)述，并對(duì)不同技術(shù)的差異進(jìn)行比較。
一、電鏡技術(shù)
在外泌體發(fā)現(xiàn)的早期，由于還沒(méi)有專門針對(duì)這類尺寸顆粒的分析方法，因此直接在電鏡下面觀察粒徑并統(tǒng)計(jì)是當(dāng)時(shí)的外泌體粒徑統(tǒng)計(jì)方法。但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且通量低，在面對(duì)臨床和科研中的大量樣本時(shí)顯得十分無(wú)力。
文獻(xiàn)中外泌體在電鏡TEM模式下的經(jīng)典形態(tài)
二、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù) & 納米粒子跟蹤分析技術(shù)
由于外泌體與材料學(xué)所合成的脂質(zhì)體在形態(tài)上十分相似，因此用于脂質(zhì)體表征的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）便被應(yīng)用于外泌體的尺寸測(cè)量上。DLS利用光射到遠(yuǎn)小于其波長(zhǎng)的小顆粒上時(shí)會(huì)產(chǎn)生瑞利散射現(xiàn)象，通過(guò)觀察散射光的強(qiáng)度隨時(shí)間的變化推算出溶液中顆粒的大小。但是這種技術(shù)會(huì)受到測(cè)量物質(zhì)的顏色、電性、磁性等理化特性的影響，并且對(duì)于灰塵和雜質(zhì)十分敏感。因此使得DLS在測(cè)量尺寸較小的粒子時(shí)，測(cè)量出的粒徑與實(shí)際的分布具有較大的偏差。
為了彌補(bǔ)DLS的短板，納米粒子跟蹤分析（NTA）技術(shù)孕育而生。這種技術(shù)采用激光散射顯微成像技術(shù)，用于記錄納米粒子在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)軌跡，并通過(guò)Stokes-Einstein方程推算粒子大小。這種技術(shù)能夠?qū)?0~1000 nm的粒徑進(jìn)行測(cè)量，因此能夠提供更為地粒徑數(shù)據(jù)。在諸多文獻(xiàn)的測(cè)試中均取得了較DLS更好的精度，因此成為目前主流的外泌體尺寸測(cè)量手段。
NTA技術(shù)的工作原理與DLS技術(shù)在測(cè)量不同尺寸納米球的數(shù)據(jù)對(duì)比?？梢娤啾扔贒LS，NTA測(cè)量的粒徑分布更為。
雖然NTA取得了比DLS 更高的性，但是隨著外泌體研究的深入，其局限性也十分明顯。先NTA僅能夠測(cè)量溶液中顆粒的平均粒徑尺寸，但是NTA無(wú)法分辨其中的外泌體、囊泡、脂蛋白，也不能區(qū)別不同源性的外泌體。這直接限制了外泌體粒徑表征的意義，使得研究者很難探究外泌體尺寸與外泌體來(lái)源之間的關(guān)系。另外NTA本身對(duì)于測(cè)試時(shí)的溫度、濃度和校準(zhǔn)都有著較高要求，因此使得NTA在測(cè)試較小的粒子時(shí)其精度仍不能達(dá)到令人滿意的效果，其測(cè)試結(jié)果卻仍與電鏡、AFM等成像技術(shù)所觀測(cè)到的粒徑存在著明顯差異。
外泌體在TEM下的成像及粒徑統(tǒng)計(jì)與NTA測(cè)量的結(jié)果對(duì)比。可見NTA測(cè)量到的粒徑要比TEM直接測(cè)量的結(jié)果大50~100 nm。
三、單粒子干涉反射成像技術(shù)
為了解決上述在實(shí)際測(cè)試中的問(wèn)題，一種新型的單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)孕育而生。這種技術(shù)摒棄了布朗運(yùn)動(dòng)軌跡追蹤方法，通過(guò)基底與顆粒形成的相干光進(jìn)行成像，通過(guò)成像后的亮度來(lái)直接計(jì)算納米粒子的大小。從而避免了NTA測(cè)量粒徑軌跡誤差大的短板，擁有更高的靈敏度和精度，即使對(duì)于NTA無(wú)法區(qū)分的40 nm與70 nm的粒子混合溶液也依然能夠取得很好的分辨率。
SP-IRIS的原理及芯片微陣列打印的成像效果和對(duì)混合不同粒徑小球的區(qū)分效果。可見SP-IRIS技術(shù)擁有更高的測(cè)試通量和測(cè)量精度。
得益于這種高精度測(cè)量方法，越來(lái)越多的研究者終于能夠測(cè)量到與電鏡直接觀測(cè)相當(dāng)?shù)牧?。這種優(yōu)勢(shì)所帶來(lái)的效果不單單是能夠讓TEM的數(shù)據(jù)與納米粒子表征的數(shù)據(jù)更為一致，同時(shí)還能夠表征不同來(lái)源的外泌體之間的粒徑差異。
SP-IRIS、NTA和TEM統(tǒng)計(jì)同一樣品時(shí)所測(cè)量的粒徑分布。SP-IRIS在測(cè)量不同尺寸的外泌體時(shí)，測(cè)量的粒徑與TEM的尺寸統(tǒng)計(jì)基本一致，而NTA統(tǒng)計(jì)的粒徑則比TEM大約50 nm。此外SP-IRIS技術(shù)還能夠提供不同來(lái)源外泌體的尺寸差異，能夠看出CD9來(lái)源的外泌體要比其它來(lái)源的外泌體大~10 nm。
SP-IRIS的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于能夠更換激光源的波長(zhǎng)，因此除了能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的形貌成像外，還能夠?qū)崿F(xiàn)單外泌體的熒光成像。使得單外泌體的熒光共定位成為可能，研究者通過(guò)這種單外泌體熒光成像能夠研究單外泌體的表型、載物、來(lái)源等生物信息。
使用SP-IRIS 對(duì)受傷組和對(duì)照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清CD9、CD81來(lái)源外泌體的分泌量監(jiān)測(cè)。可以看到CD81來(lái)源的外泌體的分泌量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而CD9來(lái)源的外泌體分泌量則一直在增加。
綜上所述，由于SP-IRIS技術(shù)的高精度、高靈敏度、可做單外泌體熒光成像的優(yōu)勢(shì)，目前有越來(lái)越多的學(xué)者開始對(duì)比NTA技術(shù)和SP-SPIS技術(shù)，其結(jié)果均認(rèn)為SP-SPIS技術(shù)測(cè)試的效果要明顯優(yōu)于NTA，這其中也不乏Cell等高水平期刊。相信在不久的將來(lái)，SP-IRIS技術(shù)將會(huì)越來(lái)越普及，為研究者研究外泌體打開新的大門。
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