免疫組化(IHC)是病理診斷的主要輔助手段之一。雖然免疫組化在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)常規(guī)開(kāi)展，但是由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室選擇的抗體試劑廠家、抗原修復(fù)方法、檢測(cè)系統(tǒng)等不同，免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作方法亦不相同，染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)各種差異。免疫組化染色技術(shù)操作步驟看似簡(jiǎn)單，但步驟較多且環(huán)環(huán)相扣，而且許多因素影響著免疫組化的結(jié)果，包括技術(shù)人員是否熟練掌握整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作程序、抗體的特異性、檢測(cè)方法的敏感性、組織標(biāo)本的固定、抗原的修復(fù)及修復(fù)液的PH值等眾多因素。所以，完成一張滿意的免疫組化切片并非那么簡(jiǎn)單。20世紀(jì)末，非生物素型聚合物(Polymer)檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，可以有效地防止內(nèi)源性生物素的干擾，而且靈敏度高，操作便捷，已被免疫組化實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。當(dāng)前，免疫組化技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的討論是建立在由福爾馬林固定，石蠟包埋的組織切片并使用非生物素型聚合物檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上而展開(kāi)的。
1、免疫組化染色前的處理：組織的固定、取材、脫水、包埋、切片與展片、烤片、脫蠟
(1)組織的固定：固定的目的是防止組織、細(xì)胞自溶與腐敗，凝固或沉淀組織、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，以保持組織和細(xì)胞固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。對(duì)免疫組化而言更重要是保存組織、細(xì)胞內(nèi)的抗原，防止抗原破壞和彌散。需高度重視的是手術(shù)或穿刺離體組織必須馬上放于標(biāo)本袋固定，固定后應(yīng)與病理申請(qǐng)單及時(shí)送交病理科。病理醫(yī)生有責(zé)任與手術(shù)送檢科室進(jìn)行必要的配合與溝通，避免手術(shù)后的病理標(biāo)本隨意丟放。
由于免疫組化的固定劑種類(lèi)較多，性能各異，不同抗原其穩(wěn)定性各不相同，因此，要了解不同固定劑的特征。常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性緩沖福爾馬林滲透力強(qiáng)、組織收縮小，能使大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，提高免疫組織化學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性率，因此推薦作為病理標(biāo)本的首選固定液。應(yīng)避免使用含重金屬的固定劑。
10%中性緩沖福爾馬林配制方法：① 40%甲醛100ml;② 磷酸二氫鈉4g;③ 磷酸氫二鈉6.5g;④ 蒸餾水900ml。
固定液的量一般為組織塊總體積的5-10倍，小標(biāo)本固定時(shí)間為4-6小時(shí)，大標(biāo)本為18-24小時(shí)。固定時(shí)間不宜超過(guò)24小時(shí)，以防止組織經(jīng)甲醛過(guò)度固定造成的組織抗原損失和抗原活性降低。
(2)取材：組織標(biāo)本的取材厚度一般為0.3cm(不應(yīng)>0.5cm)，面積一般為(1.0-1.5)cm x (1.0-1.5)cm。
(3)脫水：組織在脫水機(jī)中的處理需十分恰當(dāng)，大量的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)公認(rèn)加熱抗原修復(fù)過(guò)程中組織脫片的主要原因是取材過(guò)厚以及脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。
(4)包埋與切片：組織經(jīng)過(guò)脫水、透明及浸蠟后，進(jìn)行石蠟包埋。包埋的石蠟過(guò)熱或溫度過(guò)高容易導(dǎo)致組織抗原的破壞，尤其對(duì)于固定不佳的組織，需選用低熔點(diǎn)的石蠟(熔點(diǎn)<60°C)。
(5)切片與展片：切片也是免疫組化染色的重要環(huán)節(jié)，一般厚度在3-5um之間，淋巴結(jié)/淋巴組織和腎穿組織切片應(yīng)該更薄些。切片要求完整，厚薄均勻，無(wú)皺褶無(wú)刀痕，太厚會(huì)影響免疫組化染色結(jié)果和判斷，還容易在染色過(guò)程中發(fā)生脫片。展片可采用二次展片，所謂二次展片：是指在展片過(guò)程中，先將組織切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，進(jìn)行第一次展片，然后將切片撈起放入45-50°C的溫水中進(jìn)行第二次展片。此方法的優(yōu)點(diǎn)是酒精溶液于水之間有一個(gè)張力差，這樣處理可得到平整無(wú)皺褶的組織切片，但像脂肪之類(lèi)細(xì)胞間粘附性較小的組織接觸酒精后會(huì)散開(kāi)，不建議采用此法。
(6)烤片：推薦58-60°C恒溫箱烤片2-3小時(shí)，但不能進(jìn)行高溫烤片，因?yàn)樵诟稍锏臈l件下加熱切片可以加速組織內(nèi)抗原的氧化而破壞組織中的抗原，使抗原定位不明確。
(7)暫不染色切片的保存：進(jìn)行免疫組化染色最好采用新切片。在實(shí)際工作中，蠟塊面端可以采用蠟封來(lái)避免抗原損失以便長(zhǎng)期保存。如果切好暫不染色的切片，應(yīng)該將切片放置于4°C冰箱短時(shí)間保存。
(8)脫蠟：免疫組化的脫蠟過(guò)程與常規(guī)HE脫蠟步驟相同。
2、免疫組化抗體的選擇、稀釋和保存
(1)選擇：選擇抗體應(yīng)先了解其反應(yīng)譜和適用條件(包括適用切片<石蠟切片或冰凍切片>、稀釋度及溫育時(shí)間等)。使用一種新抗體時(shí)，必須首先摸索出最佳滴度，所謂最佳滴度就是能獲得最佳特異反應(yīng)所需抗原的最低濃度?；蛘甙凑沼嘘P(guān)說(shuō)明書(shū)的提示。
(2)稀釋?zhuān)孩?一般用0.01M PBS，PH值7.2;② 或用0.05M TBS，PH值7.6;③ 必要時(shí)可按需要加適量小牛血清清蛋白。
(3)保存：合理地保存使用抗體十分重要，這樣才能最大限度地發(fā)揮抗體的作用，使抗體不致在短期內(nèi)失去活性。①濃縮型抗體：應(yīng)先根據(jù)廠家提供的效價(jià)，將其分類(lèi)?？砂?ul、10ul、20ul等至100ul為一單位分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料離心管中，并注明標(biāo)記(批號(hào)、名稱(chēng)、效價(jià)、量)，密封后放入-20°C —-40°C低溫冰箱中保存，用時(shí)按需用量取出，稀釋后置4°C冰箱保存使用，切勿反復(fù)凍存，以免效價(jià)降低;②即用型抗體可置于4°C冰箱中保存。遠(yuǎn)程運(yùn)送，路途攜帶，郵寄抗體時(shí)，應(yīng)加冰、干冰、防濕材料，以免影響效價(jià)。
3、免疫組化中被測(cè)組織的抗原修復(fù)
(1)組織細(xì)胞經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定后，其切片中的抗原決定簇因醛的交聯(lián)作用而被封閉，抗原結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)發(fā)生顯著的改變，表位空間結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致許多抗原免疫活性丟失，影響了抗原的定位。目前在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素之一。
常用的抗原修復(fù)方法是加熱抗原修復(fù)法和酶消化法。有些抗體不需要進(jìn)行抗原修復(fù)，有些抗體需要酶消化法，有些抗原需要加熱修復(fù)法，有些抗體則需要幾種抗原修復(fù)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用(抗原雙重修復(fù)法)，至于哪種抗體是否需要抗原修復(fù)以及如何修復(fù)，一般試劑公司在產(chǎn)品目錄或說(shuō)明書(shū)上會(huì)予以說(shuō)明。
(2)酶消化法：現(xiàn)免疫組化實(shí)驗(yàn)室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法。① 胰蛋白酶消化法：濃度一般是0.05-0.1%，37°C下溫育15-30分鐘;② 胃蛋白酶消化法：濃度一般為0.04%，37°C下溫育10-30分鐘。
(3)加熱抗原修復(fù)法：主要包括：高壓法、微波法、水浴法。
英聯(lián)邦免疫細(xì)胞化學(xué)室間質(zhì)控組織(UK NEQAS-ICC)進(jìn)行過(guò)一項(xiàng)由105家實(shí)驗(yàn)室參與，歷時(shí)兩年(1996年8月-1998年8月)的研究對(duì)ER、PR進(jìn)行8次循環(huán)反饋實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室間實(shí)驗(yàn)方法的比較的結(jié)論，就目前實(shí)驗(yàn)室間ER、PR染色結(jié)果偏弱的原因最終得出一致性實(shí)驗(yàn)結(jié)論，即由于微波加熱時(shí)間不足與實(shí)驗(yàn)室中操作控制不當(dāng)所致，故強(qiáng)烈推薦使用高壓抗原修復(fù)方法。
抗原修復(fù)必須使用耐高溫塑料切片架，不能使用銅染色架，以防止因修復(fù)液PH值改變抗原修復(fù)效果，修復(fù)結(jié)束后必須等修復(fù)液冷卻至室溫后，才能取出切片，取出后的切片需要用自來(lái)水充分洗滌，修復(fù)液的量必須保證所有切片都能浸泡到，無(wú)論哪一步驟都不能使切片干燥。用過(guò)的檸檬酸修復(fù)液或EDTA修復(fù)液不建議反復(fù)使用。影響抗原修復(fù)的基本因素是加熱的溫度和時(shí)間以及加熱處理時(shí)浸泡切片的抗原修復(fù)液的PH。
(4)抗原修復(fù)液的選擇：加熱抗原修復(fù)液有多種，如檸檬酸修復(fù)液(PH6.0)、EDTA修復(fù)液(PH8.0-9.0)、EGTA(PH9.0)、Tris修復(fù)液(PH10.0)，至于需要哪種修復(fù)液，應(yīng)該根據(jù)試劑公司提供的產(chǎn)品目錄或說(shuō)明書(shū)上的預(yù)處理方法。
4、防脫玻片的制備
由于免疫組化過(guò)程長(zhǎng)，組織切片長(zhǎng)時(shí)間浸泡在緩沖液和試劑內(nèi)經(jīng)過(guò)多次沖洗浸泡和作用，尤其是在抗原修復(fù)過(guò)程中，由于高溫、高壓、輻射等因素的影響，極易造成脫片，因此，必須在載玻片上涂上粘附劑，增加切片的粘附作用。一般采用多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)和APES兩種粘附劑。
① 多聚賴氨酸防脫玻片的制備：多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)1份;蒸餾水9份。
配制方法：取多聚賴氨酸1份，蒸餾水9份，置于干凈的玻璃容器中，混合均勻，將充分洗凈、預(yù)先干燥的玻片浸泡入稀釋好的多聚賴氨酸中5-10秒，取出放置于室溫下晾干或60°C干燥箱內(nèi)烘干備用。處理后的玻片避光干燥可長(zhǎng)期保存、備用。濃縮多聚賴氨酸液室溫(18-26°C)貯存，有效期12個(gè)月。稀釋后的工作液2°C-8°C冰箱保存，有效期3個(gè)月。
?、?APES玻片的制備：APES1份;丙酮50份。
配制方法：取APES1份，丙酮50份，置于干凈的玻璃容器中，充分?jǐn)嚢杈鶆?。將洗凈的玻片放入稀釋好的APES液中20-30秒后取出，稍停，在放入純丙酮液洗去多余的APES液，置通風(fēng)櫥中晾干即可。注意，用APES防脫玻片處理玻片撈片時(shí)組織應(yīng)一步到位，不要留有氣泡。濃縮液室溫(18-26°C)貯存，有效期12個(gè)月。
Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用且效果最好的一種防脫片劑，多聚賴氨酸溶液也可按1：10稀釋成工作液，適合于需要酶消化、微波、高壓的防脫片處理。
5、免疫組化染色
(1)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的阻斷：在一些細(xì)胞中存在過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等，它們能使H202分解，DAB沉積而著色，最常見(jiàn)的是紅細(xì)胞(血紅蛋白)，另外還有橫紋肌細(xì)胞(肌球蛋白)、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞(細(xì)胞色素)、肝細(xì)胞和腎細(xì)胞(過(guò)氧化氫酶)，如果不進(jìn)行處理，組織中紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等會(huì)干擾染色結(jié)果的判斷，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶干擾的辦法就是將組織切片浸泡在3%的H2O2中10分鐘。
(2)內(nèi)源性生物素的阻斷：抗原修復(fù)對(duì)組織中內(nèi)源性生物素受到不同程度的封閉，在加熱抗原修復(fù)增強(qiáng)抗原表位暴露的同時(shí)，也增強(qiáng)了組織中內(nèi)源性生物素的呈現(xiàn)。內(nèi)源性生物素指的是組織內(nèi)能夠與抗生素蛋白結(jié)合的分子或基團(tuán)，使用生物素-鏈霉菌抗生素蛋白的結(jié)合形成足以以假亂真的陽(yáng)性。
周小鴿等人2002年采用組織芯片技術(shù)對(duì)大范圍的正常組織和腫瘤組織進(jìn)行的系統(tǒng)性研究顯示：① 冰凍組織中存在生物素;② 經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋后的組織中生物素被封閉;③ 加熱抗原修復(fù)可造成生物素暴露;④ 生物素暴露的強(qiáng)度各不相同，強(qiáng)者可到強(qiáng)陽(yáng)性(+++);⑤ 生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中;⑥ 生物素在組織中的分布形式，特別是腺上皮組織，包括正常組織和腫瘤組織，亦存在部分非上皮組織;⑦ 生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液亦有關(guān)，PH9.0EGTA的暴露能力比PH8.0EDTA和PH6.0的檸檬酸更強(qiáng);⑧ 加熱抗原修復(fù)暴露的生物素可以被蛋清液封閉。
周小鴿等人提出建議：凡采用加熱抗原修復(fù)和生物素相關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)進(jìn)行生物素常規(guī)封閉，冰凍切片做免疫組化染色時(shí)亦應(yīng)進(jìn)行生物素常規(guī)封閉，或者采用非生物素檢測(cè)系統(tǒng)，如Envision等，堅(jiān)持使用陰性對(duì)照。
在實(shí)驗(yàn)室中一般凡進(jìn)行加熱抗原修復(fù)處理并準(zhǔn)備使用生物素-抗生素辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，免疫組化染色的組織都需要進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉處理。阻斷內(nèi)源性生物素的方法是采用卵白素-生物素(Avidin-biotin)加以封閉，在常溫下孵育20-30分鐘即可，Avidin-biotin可以與組織中內(nèi)源性生物素結(jié)合，以消除影響。但最簡(jiǎn)便的方法是使用非生物素的酶聚合物檢測(cè)系統(tǒng)。
(3)血清封閉：作為檢測(cè)試劑的抗原蛋白帶有一定的負(fù)電荷，免疫組化染色時(shí)，易與帶正電荷的組織(特別是纖維組織、變性和<或>壞死的細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等)發(fā)生靜電吸引而導(dǎo)致非特異性染色(實(shí)驗(yàn)室使用的封閉血清，一般在加一抗之前使用，選擇的血清種屬一般與二抗的種屬相同)，去除這種非特異性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于制備第二抗體動(dòng)物的非免疫血清或滴加除制備第一抗體動(dòng)物以外的其他動(dòng)物非免疫血清，濃度為1：5—1：20，正常血清保護(hù)作用時(shí)間10-20分鐘。
(4)沖洗緩沖液：實(shí)驗(yàn)室中常用沖洗緩沖液為PBS和TBS(PH7.2-7.4)。沖洗緩沖液中加入0.025%Tween-20可以增強(qiáng)緩沖液的效果。
(5)一抗孵育：① 即用型第一抗體可按照廠家提供的實(shí)驗(yàn)操作條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(邁新實(shí)驗(yàn)室針對(duì)即用型抗體穩(wěn)定性與長(zhǎng)期有效保存條件的問(wèn)題進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)1年時(shí)間對(duì)照追蹤實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果表明：即用型抗體在4°C冷藏條件下存放14個(gè)月是穩(wěn)定的);② 濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度進(jìn)行成倍稀釋預(yù)實(shí)驗(yàn)，以選擇最佳稀釋度?？贵w的最佳稀釋度是指：在無(wú)背景染色的情況下，獲得最佳強(qiáng)度陽(yáng)性信號(hào)的抗體稀釋度。一般染色背景深大多是抗體濃度過(guò)濃所致;③ 抗體孵育時(shí)的溫度一般以25°C±8°C為準(zhǔn)，在此區(qū)間內(nèi)，一抗的孵育時(shí)間為30-60分鐘。
若溫度較低應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，反之要適當(dāng)減少孵育時(shí)間，或者在4°C冰箱過(guò)夜，冰箱4°C下孵育常需要注意的是：抗體孵育應(yīng)在潮濕密封閉的環(huán)境中進(jìn)行，避免抗體水分蒸發(fā)造成抗體的濃縮或干燥，致使染色背景產(chǎn)生。高質(zhì)量的孵育盒是免疫組化的必要實(shí)驗(yàn)用品。免疫組化染色過(guò)程的試劑濃度，孵育時(shí)間是相關(guān)聯(lián)的，濃度與溫度和時(shí)間基本呈反比，即濃度過(guò)高孵育，溫度應(yīng)越低，孵育時(shí)間應(yīng)該越短，反之亦然，因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)各自的情況，合理處理三者的關(guān)系，摸索出一套適合自己的工作條件。
(6)常用檢測(cè)系統(tǒng)：目前常用的檢測(cè)系統(tǒng)為辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，主要為兩類(lèi)：① 以生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白鏈接的辣根過(guò)氧化物酶(Biotin-Streptavidin-HRP)檢測(cè)系統(tǒng)，如：SP、ABC、SABC等;② 以聚合物(Polymer)鏈接的辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，如：MaxVision、Elivision、EnVision等。這兩類(lèi)檢測(cè)系統(tǒng)都是在國(guó)內(nèi)外臨床廣泛采用的檢測(cè)方法。非生物素型酶聚合物檢測(cè)系統(tǒng)敏感性較高、操作便捷、無(wú)內(nèi)源性生物素干擾，已成為免疫組化的常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)。
(7)顯色系統(tǒng)：由于通常采用的是辣根過(guò)氧化物酶，因此選擇DAB(棕色)或AEC(紅色)作為酶底物顯色。若采用的是堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)則選擇BCLP/NBT(藍(lán)紫色)作為酶底物顯色。
?、貲AB陽(yáng)性部位呈棕色，一般以蘇木素復(fù)染。配制DAB時(shí)應(yīng)注意：a、DAB具有致癌性，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癌，使用過(guò)程中勿將試劑沾到皮膚、眼睛或衣服上，若發(fā)生此情況應(yīng)立即用大量的水沖洗，用過(guò)的DAB應(yīng)倒入清潔液中集中消毒處理;b、DAB一定要新鮮配制，如有沉淀可過(guò)濾后使用，否則未溶的DAB顆粒會(huì)沉積在切片上，影響結(jié)果的觀察，配制好的的溶液避光保存，30分鐘內(nèi)有效;c、DAB的濃度不宜太高，否則會(huì)增加背景染色。H2O2濃度也不宜太高，否則會(huì)加速反應(yīng)，也可增加背景染色。室溫下染色約為3-5分鐘，可在顯微鏡下觀察控制染色時(shí)間。DAB試劑盒冰箱4-8°C避光保存。
?、贏EC陽(yáng)性部位呈紅色，如以蘇木素或亮綠等作為背景染色，則效果更好，配制AEC時(shí)應(yīng)注意：a、配制AEC過(guò)程中勿將試劑沾到皮膚、眼睛或衣服上，若發(fā)生此情況應(yīng)立即用大量的水沖洗;b、由于終產(chǎn)物溶于乙醇中，不能用酒精處理，因陽(yáng)性棕紅色產(chǎn)物能溶于究酒精中，故需甘油明膠封片，不能長(zhǎng)期保存;c、若出現(xiàn)沉淀可過(guò)濾后使用，配制好的溶液避光存放，30分鐘內(nèi)有效，染色結(jié)果為紅色，室溫下染色約為8-20分鐘，可在顯微鏡下觀察控制染色時(shí)間。AEC試劑盒冰箱4-8°C避光保存。顯色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致背景著色，但也不宜過(guò)短，過(guò)短可導(dǎo)致假陰性染色。
(8)復(fù)染、脫水、透明、封固
免疫組化復(fù)染一般只需蘇木素淺淡的染色(1-3分鐘)，蘇木素的配方不同，但首選的是Harris蘇木素襯染。在經(jīng)0.1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水藍(lán)化，常規(guī)脫水透明后封片。
6、標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)立
免疫組化對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)立在免疫組織化標(biāo)準(zhǔn)化中是極其必要的，正確設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照，才能確保免疫組化染色過(guò)程的準(zhǔn)確性、抗體及相關(guān)試劑有效性，是對(duì)技術(shù)人員實(shí)驗(yàn)操作和試劑供應(yīng)商提供試劑質(zhì)量的驗(yàn)證，也是對(duì)患者的負(fù)責(zé)。對(duì)照的設(shè)立包括試劑對(duì)照和組織對(duì)照，分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
(1)試劑對(duì)照：主要是為了確定所使用的一抗和檢測(cè)試劑盒的特異性，替代對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或使用PBS代替一抗進(jìn)行染色。
Vimentin抗體可以作為免疫組化染色中一種很有用的陽(yáng)性對(duì)照試劑，在每次免疫組化染色中加入Vimentin染色作為陽(yáng)性對(duì)照，可以觀察甲醛固定后抗原表達(dá)的敏感性，對(duì)甲醛固定后抗原損傷的程度進(jìn)行分析。
(2)組織對(duì)照：組織對(duì)照實(shí)驗(yàn)有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和組織內(nèi)部對(duì)照。
?、?陽(yáng)性對(duì)照：對(duì)照組織中含有已知的抗原，常用的陽(yáng)性對(duì)照有多組織蠟塊、組織芯片等;② 陰性對(duì)照：用確定不含有待測(cè)抗原的組織作為陰性對(duì)照組織;③ 組織內(nèi)部對(duì)照：待測(cè)組織自身含有某種相關(guān)抗原，如淋巴結(jié)內(nèi)一定含有血管內(nèi)皮細(xì)胞，在觀察外部陽(yáng)性和陰性的同時(shí)，也要注意到內(nèi)部的表達(dá)情況，有時(shí)候可以起到相當(dāng)關(guān)鍵的作用。當(dāng)然，有不少染色或病例缺乏內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照，若對(duì)染色反應(yīng)有疑問(wèn)，只能選用另外的陽(yáng)性對(duì)照片核實(shí)，若內(nèi)(或外)陽(yáng)性對(duì)照是組織免疫反應(yīng)陰性，瘤組織陽(yáng)性則表達(dá)假陽(yáng)性;瘤組織陰性則表明假陰性，只有陽(yáng)性對(duì)照染色陽(yáng)性，瘤組織反應(yīng)才屬真實(shí)，除了觀察內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照外，還要看內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照是否有非特異性反應(yīng)。
7、免疫組化染色結(jié)果正確判讀
實(shí)驗(yàn)室染色結(jié)果的觀察、染色結(jié)果的判定需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，免疫組化染色最終是否能得到正確的結(jié)論，關(guān)鍵還要看對(duì)染色結(jié)果如何評(píng)價(jià)，在判斷免疫組化染色結(jié)果時(shí)，為確保其準(zhǔn)確性，必須要注意：① 首先應(yīng)觀察常規(guī)石蠟切片，形成初步診斷意見(jiàn)，在觀察免疫組化染色結(jié)果時(shí)，應(yīng)以有意義的組織/細(xì)胞為準(zhǔn)，即主要觀察有意義的組織/細(xì)胞的反應(yīng)是陽(yáng)性反應(yīng)還是陰性反應(yīng);② 免疫組化染色結(jié)果必須建立在組織陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)有效的基礎(chǔ)上，這是正確判斷染色結(jié)果的前提。只有當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性對(duì)照呈陰性反應(yīng)，且背景清晰時(shí)才能從正反兩面說(shuō)明抗體的稀釋度和效價(jià)準(zhǔn)確、染色方法和步驟準(zhǔn)確無(wú)誤、無(wú)交叉反應(yīng)及非特異性染色;③ 染色陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)在預(yù)期的組織/細(xì)胞結(jié)構(gòu)上定位清晰準(zhǔn)確。陽(yáng)性表達(dá)有強(qiáng)弱之分，只要在抗原的特定部位上，即使有少數(shù)細(xì)胞有抗原表達(dá)，也應(yīng)視為陽(yáng)性表達(dá);④ 陰性結(jié)果是組織細(xì)胞內(nèi)預(yù)期區(qū)域中未見(jiàn)抗原表達(dá);⑤ 免疫組化染色結(jié)果為病理診斷輔助信息，當(dāng)免疫組化染色結(jié)果與HE診斷不相符或發(fā)生矛盾時(shí)，應(yīng)以HE診斷為標(biāo)準(zhǔn)，而不能簡(jiǎn)單的用免疫組化染色結(jié)果推翻、否定HE診斷，應(yīng)在多做抗體標(biāo)記并結(jié)合臨床資料及實(shí)驗(yàn)室影像學(xué)檢查等全面綜合分析再做出正確診斷。
染色陽(yáng)性的判斷：特別要注意內(nèi)源性生物素造成的非特異性染色(如在肝、腎及富含線粒體的細(xì)胞等)，常常表現(xiàn)為非特異的胞漿陽(yáng)性?？傊?，只有陽(yáng)性對(duì)照染成陽(yáng)性，陰性對(duì)照基本陰性，這樣的免疫組化染色結(jié)果才可信。
一般來(lái)講，免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果比陰性結(jié)果更有意義，因?yàn)殛幮越Y(jié)果可能緣于許多因素，可能抗原的確不存在，或抗原含量低，組織處理時(shí)抗原丟失，染色方法不敏感或操作有誤。在免疫組化鑒別診斷過(guò)程中，大多數(shù)染色結(jié)果的判讀為陽(yáng)性或陰性即可，但在某些特殊情況下，如腫瘤組織中激素受體含量、分子靶向治療藥效，細(xì)胞增殖指數(shù)等進(jìn)行免疫組化檢測(cè)時(shí)，染色結(jié)果可用半定量計(jì)數(shù)法。
染色強(qiáng)度：(-)陰性、(±)弱陽(yáng)性、(++)中度陽(yáng)性、(+++)高度陽(yáng)性;陽(yáng)性細(xì)胞分布：(-)陰性、(+)少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性、(++)中等細(xì)胞陽(yáng)性、(+++)多數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性。
8、免疫組化報(bào)告
免疫組化實(shí)驗(yàn)報(bào)告已經(jīng)融合在病理常規(guī)報(bào)告中，除了在本醫(yī)院病理科與手術(shù)送檢科室之間進(jìn)行程序化的規(guī)范使用外，隨著各個(gè)病理科實(shí)驗(yàn)室間的交流日益廣泛，標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組化報(bào)告已成為必不可少的交流資料。免疫組化實(shí)驗(yàn)報(bào)告中包括如下內(nèi)容：
(1)病人的一般資料介紹;
(2)免疫組化檢測(cè)系統(tǒng);
(3)注明所選擇抗體的品名、克隆號(hào)、細(xì)胞定位及表達(dá)意義;
(4)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)立;
(5)醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果的詮釋。
最大限度、正確地?cái)⑹龃郎y(cè)組織中抗原表達(dá)信息是病理免疫組化報(bào)告的基本要求。在條件允許下，病理免疫組化報(bào)告單應(yīng)附有免疫組化染色圖片。
參考書(shū)目
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[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著。臨床技術(shù)操作規(guī)程病理學(xué)分冊(cè)。北京：人民衛(wèi)生出版社，2004.
作者：徐開(kāi)軍(云南省第三人民醫(yī) 院病理科)
