YIJI組織 AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI組織 AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到 AMPK磷酸化后，進而
由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產(chǎn)生 ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核
苷酸（NADH）的氧化反應，即采用比色法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中 AMPK
活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂
解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中 AMPK 激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的
篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
技術(shù)背景
5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine
protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進化保留的激酶復合物，由3個亞體，α、β、γ構(gòu)
成：其中γ亞體有4個胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結(jié)構(gòu)域，又稱為巴特曼（Bateman）結(jié)
構(gòu)域，以探測AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結(jié)構(gòu)域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 復合
物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構(gòu)體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2
和γ3。其功能在于保持細胞能量內(nèi)環(huán)境恒定：促進脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進肌肉葡萄糖吸收
和調(diào)節(jié)胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達。其磷酸化目標序列為 LKKLTRASFFGQ。
基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，
進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還
原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌
呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析5’AMP活化
蛋白激酶的活性。其反應方式為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A）
YIJI裂解液（Reagent B）
YIJI緩沖液（Reagent C）
YIJI酶促液（Reagent D）
YIJI反應液（Reagent E）
YIJI底物液（Reagent F）
YIJI陰性液（Reagent G）
保存方式
保存 YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍
融；有效保證6月
1用戶自備
AMPK激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
（微型）臺式離心機：用于細胞預處理
比色皿或酶標板：用于比色分析操作的容器
分光光度儀或酶標儀：用于樣品比色分析
實驗步驟
一、 待測樣品準備
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重 500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預冷的 15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入
毫升 YIJI清理液（Reagent A）清洗
4． （選擇步驟）抽去清理液
5． 移入到一個液氮凍存管
6． 即刻放進液氮罐過夜
7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8． 放進一個 15毫升錐形離心管
9． 加入置于冰槽里的
微升 YIJI裂解液（Reagent B）
10．強力渦旋震蕩 30秒，充分混勻
11．放進冰槽里孵育 30分鐘，期間每 10分鐘強力渦旋震蕩 30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱
里儲存?zhèn)溆茫?/p>
12．即刻放進 4℃臺式離心機離心 10分鐘，速度為 10000g
13．小心移取上清液到新的無菌的 1.5毫升離心管
14．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJIBradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
YJ30030.1）
15．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1分鐘，讀數(shù) 6次（共 5分鐘），并置零
三、 背景對照測定
1． 移取
2． 加入
3． 加入
微升 YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
微升 YIJI酶促液（Reagent D）
微升 YIJI陰性液（Reagent G）
4． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2分鐘
5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
6． （選擇步驟）取出比色皿
2
7． 加入
8． 加入
微升 YIJI反應液（Reagent E）
微升 YIJI底物液（Reagent F）
9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3秒之內(nèi)）
10．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù) 0分鐘 －340波長讀數(shù) 5分鐘
四、 樣品測定
1． 移取微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入微升 YIJI酶促液（Reagent D）
3． 加入 5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）
4． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2分鐘
5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
6． （選擇步驟）取出比色皿
7． 加入微升YIJI反應液（Reagent E）
8． 加入升YIJI底物液（Reagent F）
9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3秒之內(nèi)）
10．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)：340波長讀數(shù) 0分鐘 －340波長讀數(shù) 5分鐘
五、 計算樣品活性
單位＝微摩爾 NADH/分鐘
六、酶標板測定
1． 在 96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取微升YIJI緩沖液（Reagent C）到 96孔板中
3． 分別加入微升 YIJI酶促液（Reagent D）
4． 分別加入 5微升 YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔
中（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動 96孔酶標板
6． 在 30℃溫度下孵育 2分鐘
7． 分別加入微升YIJI反應液（Reagent E）
8． 分別加入微升YIJI底物液（Reagent F）
9． 輕輕搖動酶標板
10．即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和 5分鐘讀數(shù)
11．活性計算：
單位＝微摩爾 NADH/分鐘
七、抑制劑篩選
3
1． 在 96孔酶標板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
2． 按下表加入試劑
內(nèi)容物
樣本背景
微升
完全酶活性
微升
待測抑制劑酶活性
微升
YIJI緩沖液
（Reagent C）
YIJI陰性液
（Reagent G）
待測抑制劑
微升
——
——
微升
——
――
微升
用戶自備的純化酶
96孔板每孔總量
微升（1毫單位）
完全活性孔
（ 微升）
微升（1毫單位）
待測抑制劑樣品孔
（ 微升）
樣本背景孔
（ 微升）
3． 輕輕搖動酶標板，混勻
4． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 30分鐘
5． 分別加入
6． 分別加入
7． 分別加入
微升 YIJI酶促液（Reagent D）
微升 YIJI反應液（Reagent E）
微升 YIJI底物液（Reagent F）
8． 輕輕搖動酶標板
9． 即刻放進酶標儀檢測：獲得初始吸光讀數(shù)（OD）
10．放進 30℃培養(yǎng)箱里孵育 30分鐘
11．即刻放進酶標儀檢測：獲得終點吸光讀數(shù)（OD）
12．實際吸光讀數(shù)：初始吸光讀數(shù)（OD）—終點吸光讀數(shù)（OD）
13．抑制活性計算：
1)
2)
IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度
3） 直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數(shù) OD；橫座標（X軸）為已知抑制劑濃度
注意事項
1． 本產(chǎn)品為 25次操作，包括背景操作
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1次
4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要
6． 加入 YIJI底物液（Reagent F）后 3秒內(nèi)即刻比色測定
7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 30分鐘
8． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
9． 樣本測定 0分鐘讀數(shù)高于 5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 YIJIBradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
YJ30030.1）
11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
4
12．可以使用 AMPK抑制劑（DORSOMORPHIN）作為抑制劑對照或陰性對照
13．5’AMP活化蛋白激酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1微摩爾
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
14．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
