Multiplex植物多參數(shù)熒光技術(shù)是一種新型的手持式植物熒光傳感器技術(shù)，用于非破壞性測量植物生理狀態(tài)相關(guān)的多種參數(shù)。Multiplex植物多參數(shù)熒光技術(shù)使用多種激發(fā)光源(UV、藍(lán)、綠、紅)來激發(fā)各種植物材料的熒光，比如葉片、針葉、作物、草地、果實、蔬菜、谷物等。它可以非破壞地同步測量20項參數(shù)(表1，Zhang, 2012)，比如花青素、黃酮和葉綠素的含量，葉綠素?zé)晒饧ぐl(fā)比和UV(紫外)激發(fā)的藍(lán)綠熒光(BGF)等。

　　表1. MULTIPLEX測量參數(shù)描述(Zhang, 2012)

　　這項技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物逆境生理研究;病蟲害早期預(yù)測;施肥管理、蛋白含量預(yù)測;蔬菜品質(zhì)及收獲期判斷;遙感，精準(zhǔn)農(nóng)業(yè);次生代謝物質(zhì)研究;葡萄酒、茶多酚、蘋果多酚原料選擇;其他水果等香氣物質(zhì)測量及收獲期判斷;中藥有效成分分析及品種選育;芳香植物有效成分分析及品種選育;觀賞植物如花卉、觀葉植物等優(yōu)良品種選育等研究和育種中。

　　Multiplex熒光技術(shù)可以快速無損地檢測色素和無色的黃酮，而它們可以用來評估蘋果的成熟度和品質(zhì)。Betemps使用Multiplex熒光儀檢測了三種不同品種的蘋果，富士(Fuji)、澳洲綠蘋果(Granny Smith)和金冠(Golden Delicious)(圖1，Betemps, 2012)。

　　圖1. A. 便攜式Multiplex熒光儀 B. 富士(Fuji) C. 澳洲綠蘋果(Granny Smith) D.金冠(Golden Delicious) 圖2. ANTH、FLAV和CHL與花青素、黃酮和葉綠素實際含量的線性回歸關(guān)系(Betemps, 2012)

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有品種陽面的黃酮指數(shù)(FLAV)都要高于陰面。富士陽面的花青素指數(shù)(ANTH)要高于陰面。而綠蘋果和金冠陰面的葉綠素指數(shù)(CHL)要高于陽面。與破壞性方法萃取蘋果皮測量得到的花青素、黃酮和葉綠素含量相比，ANTH、FLAV和CHL都與其有極好的線性回歸關(guān)系(圖2)。而蘋果糖分含量與葉綠素?zé)晒獾倪h(yuǎn)紅光譜帶之間發(fā)現(xiàn)了負(fù)相關(guān)關(guān)系。

　　Cerovic則使用MULTIPLEX熒光儀為波爾多一處葡萄園中每一株葡萄描繪了一張花青素和黃酮地圖(圖3，Cerovic，2009)。

　　圖3. Multiplex熒光儀 A)在田間進(jìn)行測量;B)熒光儀頂視圖;C)光學(xué)探頭前視圖，可見LED光源(6個UV和3個RGB)和中間的3個檢測器(YF，F(xiàn)RF，RF)(Cerovic，2009)

　　他們希望通過使用Multiplex技術(shù)進(jìn)行多年的研究，從而描述葡萄品質(zhì)特性的變化。初步研究中發(fā)現(xiàn)花青素和葡萄產(chǎn)量間存在弱相關(guān)性。由于土壤特性的差別，造成了每一個小樣地之間都會存在差異(圖4)。

　　圖4. 反映果實特性的Multiplex參數(shù)的空間變化圖(Cerovic，2009)

　　葉綠素?zé)晒庵邪丝梢陨钊敕从持参锕夂舷到y(tǒng)電子傳遞鏈狀態(tài)的大量信息。因此從上世紀(jì)70年代開始，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)就逐漸成為一種極為重要的植物生理研究技術(shù)。而FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)正是這一技術(shù)最先進(jìn)的代表。關(guān)于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的詳細(xì)介紹請見《FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)及其應(yīng)用》。

　　由于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以直接反映植物的受脅迫狀況，因此經(jīng)常與Multiplex植物多參數(shù)熒光技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用在研究中(Tremblay，2012)。Suthaparan在研究UV-B對黃瓜白粉病影響時，就同時使用了Multiplex熒光儀和葉綠素?zé)晒鈨x。分別測量不同時間UV-B照射后，花青素、黃酮和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的差異(表2，Suthaparan，2014)。

　　表2. 黃瓜感染白粉病并照射不同時間UV-B后的花青素、黃酮和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　表2. 黃瓜感染白粉病并照射不同時間UV-B后的花青素、黃酮和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)尤其是其獨有的多光譜熒光成像技術(shù)不但可以測量葉綠素?zé)晒鈪?shù)并成像，而且能夠測量Multiplex中的絕大部分參數(shù)并成像，同時還具備許多MULTIPLEX和傳統(tǒng)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)不具備的功能。

　　FluorCam系列葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)中可以進(jìn)行MCF成像分析的系統(tǒng)有FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)，F(xiàn)luorCam開放式多光譜熒光成像系統(tǒng)和FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)。FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)和FluorCam開放式多光譜熒光成像系統(tǒng)都具備三種激發(fā)光：紅色、藍(lán)色和紫外光，同時內(nèi)置7位濾波輪和相應(yīng)光學(xué)濾波器，不僅可以進(jìn)行一般的葉綠素?zé)晒獬上穹治?，還可進(jìn)行 UV-MCF 熒光成像分析和GFP熒光蛋白等成像分析。同時，F(xiàn)luorCam開放式多光譜熒光成像系統(tǒng)由于其獨特的模塊式組合，具備多功能、高靈活性和高度擴(kuò)展性能，還可選配綠色光源、青色光源等各種LED激發(fā)光源，對其它熒光蛋白與熒光染料如BFP、CFP、YFP等熒光蛋白進(jìn)行熒光成像分析研究。

　　圖5. FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)

　　圖6. FluorCam開放式多光譜熒光成像系統(tǒng)

　　FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)則是目前功能最為強(qiáng)大全面的藻類/植物顯微熒光研究儀器，不僅可以進(jìn)行微藻、單個細(xì)胞、單個葉綠體甚至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、MCF多光譜熒光、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等各種熒光成像動力學(xué)分析;還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的光譜分析測量，從而進(jìn)行藻青蛋白、藻紅蛋白等藻類特有光合色素的成像分析;更可以利用光譜儀對各種激發(fā)光和熒光進(jìn)行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)(例如，PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等)以及MCF全光譜圖分析。除對葉綠素?zé)晒鈩討B(tài)進(jìn)行成像光譜分析外，還可對靜態(tài)熒光如GFP熒光、DAPI熒光、DiBAC4熒光、SYTOX 綠色熒光、CTC熒光染色等熒光蛋白、熒光素進(jìn)行成像分析。

　　圖7. FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

　　由于FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)具備紅光、藍(lán)光、綠光、UV等多種光源和相應(yīng)的濾波器，因此使其不但可以測量和計算Multiplex技術(shù)中相應(yīng)的參數(shù)，而且可以通過CCD成像反映植物不同部位的細(xì)微差異，測量樣品范圍擴(kuò)展到了整株植物到微藻、單個細(xì)胞、單個葉綠體甚至基粒-基質(zhì)類囊體片段。

　　Pineda使用辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)的兩種不同毒株感染Nicotiana benthamiana。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGF成像能在檢測到病毒之前就發(fā)現(xiàn)病毒引起了葉片變化。而葉綠素?zé)晒鈩t驗證了病毒感染對植物光合系統(tǒng)的影響。熒光比率F440 ? F690 和F440 ? F740在感染后明顯增加(圖8)。Pineda認(rèn)為這兩項參數(shù)是生物脅迫檢測的極佳指標(biāo)(Pineda，2008)。此研究中測量了F440、F520、F690、F740。其中F440、F520即為將Multiplex中BGF-UV以更高的光譜分辨率分為了綠色和藍(lán)色熒光(BGF即為藍(lán)/綠熒光的縮寫);F690即為RF-UV;F740即為FRF-UV。如果使用其他藍(lán)色、紅色或者綠色光源進(jìn)行激發(fā)，即可測得Multiplex其他熒光參數(shù)并據(jù)此計算葉綠素指數(shù)、黃酮指數(shù)和花青素指數(shù)等。

　　圖8. 感染 PMMoV 的Nicotiana benthamiana的 F440 ?F520，F(xiàn)440 ?F690，F(xiàn)440 ? F740和F690 ?F740熒光比率圖(Pineda，2008)

　　參考文獻(xiàn)：

　　1.Zhang Y P, et. al, 2012, A first comparison of Multiplex? for the assessment of corn nitrogen status, Journal of Food, Agriculture & Environment, 10 (1): 1008-1016

　　2.Betemps, et. al, 2012, Non‐destructive evaluation of ripening and quality traits in apples using a multiparametric fluorescence sensor, Journal of the Science of Food and Agriculture, 92(9):1855–1864

　　3.Cerovic Z G, et. al, 2009, Mapping winegrape quality attributes using portable fluorescence-based sensors, Frutic, 9:301-310

　　4.Tremblay N, et. al, 2012, Sensing crop nitrogen status with fluorescence indicators. A review, Agron. Sustain. Dev., 32:451–464

　　5.Suthaparan A, et. al, 2014, Suppression of Cucumber Powdery Mildew by Supplemental UV-B Radiation in Greenhouses Can be Augmented or Reduced by Background Radiation Quality, Plant Disease, 98(10):1349-1357

　　6.Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060