熒光和熒光壽命
分子包含多個單能態(tài)S0、S1、S2…和三重態(tài)T1…，每個能態(tài)都包含多個精細(xì)的能級。正常情況下，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級上，當(dāng)分子被光束照射，會吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時間，便會通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1 上，而S1 能態(tài)上的電子亦會在極短時間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級上，而這些電子會存在一段時間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個過程會釋放一個光子，即熒光。
此外，亦會有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài)，我們稱之為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時，主要在以下幾方面進(jìn)行分析：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、偏振熒光、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時間（納秒量級）。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時域測量和頻域測量時間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測試曲線：
1 時域測量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1，接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時間的變化。其中目前廣泛應(yīng)用的是時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC) 實(shí)現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試，此方法對數(shù)據(jù)的獲取完全依賴快速探測器和高速電路。用統(tǒng)計(jì)的方法計(jì)算樣品受激后發(fā)出的一個( 也是*一的一個) 光子與激發(fā)光之間的時間差，也就是下圖的START( 激發(fā)時刻) 與STOP( 發(fā)光時刻) 的時間差。由于對于Stop 信號的要求，所以TCSPC 一般需要高重復(fù)頻率的光源作為激發(fā)源，其重復(fù)至少要在100KHz 以上，多數(shù)的光源都會達(dá)到MHz 量級；同時，在一般情況下還要對Stop 信號做數(shù)量上的控制，做到盡量滿足在一個激發(fā)周期內(nèi)，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個光子的有效熒光信號，避免光子對的出現(xiàn)。
2 頻域測量
對連續(xù)激發(fā)光進(jìn)行振幅調(diào)制后，分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度也會受到振幅調(diào)制，兩個調(diào)制信號之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差，因此可以測量該相位差計(jì)算熒光壽命。
左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光（綠色）頻域顯示，發(fā)射光信號（紅色）相應(yīng)的相位變化頻域顯示。
右圖為對應(yīng)不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示。TM- 調(diào)制壽命，TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）
顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，F(xiàn)LIM）是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù)，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無法代替的優(yōu)異性能，目前在生物醫(yī)學(xué)工程、光電半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM。
寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號，再由一寬場相機(jī)采集熒光成像。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時域或是頻域壽命采集都可以應(yīng)用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點(diǎn)獲取其熒光衰減曲線，再經(jīng)過擬合終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM，其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優(yōu)勢。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動激光進(jìn)行掃描，一種是固定激光，電動位移臺帶動樣品移動進(jìn)行掃描。
顯微熒光壽命成像系統(tǒng)FLIM應(yīng)用
材料科學(xué)領(lǐng)域
寬禁帶半導(dǎo)體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
量子點(diǎn)如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測
銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分、缺陷檢測
鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴(kuò)散研究
生命科學(xué)領(lǐng)域
細(xì)胞體自身熒光壽命分析
自身熒光相對熒光標(biāo)記的有效區(qū)分
活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測量
局部氧氣濃度測量
具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分
活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測量
時間分辨共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級尺度上的遠(yuǎn)差測量，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
應(yīng)用案例
1 用熒光分子對海拉細(xì)胞進(jìn)行染色
用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對海拉細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞的一種） 進(jìn)行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍(lán)色）到2.5ns（紅色）；
(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細(xì)胞中其他位置壽命較長，在1.8ns 附近。
用熒光分子轉(zhuǎn)子的時間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標(biāo)簽特性，且與熒光團(tuán)的濃度無關(guān)。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽命是熒光團(tuán)到金表面距離的函數(shù)；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記乳腺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜的共聚焦xz 橫截面，垂直比例尺：5m；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表面附近的GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽能電池
下圖研究中，展示了一種動態(tài)熱風(fēng)（DHA）制備工藝來控制全無機(jī)PSC 的薄膜形態(tài)和穩(wěn)定性，該工藝不含有常規(guī)的有害反溶劑，可以在大氣環(huán)境中制備。同時，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（BaI2:CsPbI2Br）。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結(jié)晶，從而形成穩(wěn)定的全無機(jī)PSC。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相。經(jīng)過DHA處理的鈣鈦礦光伏器件，在0.09cm小面積下，效率為14.85%，在1x1cm的大面積下，具有13.78%的效率。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍(lán)寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共焦PL mapping 圖像。具有較小尺寸的發(fā)光團(tuán)的高密度是觀察到在GaN 上生長的MQWs。在(c) 藍(lán)寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對于在GaN 上生長的MQWs，強(qiáng)的PL 強(qiáng)度區(qū)域與較長PL 衰減時間的區(qū)域很好地匹配。在(e) 藍(lán)寶石和(f)GaN 上生長的MQWs 在A 點(diǎn)和B 點(diǎn)測量的局部PL 衰減曲線，均標(biāo)記在圖中。對于在GaN 上生長的MQWs，點(diǎn)A 和B 之間的PL 衰減時間差更高。
顯微熒光壽命成像系統(tǒng)FLIM參數(shù)配置
北京卓立漢光儀器有限公司提供的顯微熒光壽命成像系統(tǒng)是基于顯微和時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)，配合高精度位移臺得到微觀樣品表面各空間分布點(diǎn)的熒光衰減曲線，再經(jīng)過用數(shù)據(jù)擬合，得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像。是光電半導(dǎo)體材料、熒光標(biāo)記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒、幾十、幾百納秒尺度的物質(zhì)的選擇。
參數(shù)指標(biāo)：
系統(tǒng)性能指標(biāo) | |
光譜掃描范圍 | 200-900nm |
*小時間分辨率 | 16ps |
熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
配置參數(shù) | |
激發(fā)源及匹配光譜范圍 （光源參數(shù)基于 50MHz 重復(fù)頻率） | 375nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：30ps，平均功率1.5mW，熒光波段：400-850nm |
405nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：25ps，平均功率2.5mW，熒光波段：430-920nm | |
450nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：50ps，平均功率1.9mW，熒光波段：485-950nm | |
488nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：70ps，平均功率1.3mW，熒光波段：500-950nm | |
510nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：75ps，平均功率1.1mW，熒光波段：535-950nm | |
635nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：65ps，平均功率4.3mW，熒光波段：670-950nm | |
660nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：60ps，平均功率1.9mW，熒光波段：690-950nm | |
670nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：40ps，平均功率0.8mW，熒光波段：700-950nm | |
科研級正置顯微鏡 | 落射明暗場鹵素?zé)粽彰鳎?2V，100W 5 孔物鏡轉(zhuǎn)盤，標(biāo)配明場用物鏡：10×，50×，100× 監(jiān)視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有效像素：1280H*1024V，掃描方式：逐行，快門方式：電子快門 |
電動位移臺 | 高精度電動XY 樣品臺，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， *小步進(jìn)：50nm，重復(fù)定位精度：＜ 1μm |
光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀，雙入口、狹縫出口、CCD 出口， 配置三塊68×68mm 大面積光柵，波長準(zhǔn)確度：±0.1nm， 波長重復(fù)性：±0.01nm，掃描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h)， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續(xù)電動可調(diào) |
探測器：制冷型紫外可見光電倍增管，光譜范圍：185-900nm（標(biāo)配，可擴(kuò)展） | |
光譜CCD （可擴(kuò)展PLmapping） | 低噪音科學(xué)級光譜CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測面：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片， 低暗電流，*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度，風(fēng)冷，*高量子效率值>95% |
時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器（TCSPC） | 時間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時間＜ 10ns， *高65535 個直方圖時間窗口，瞬時飽和計(jì)數(shù)率：100Mcps，支持穩(wěn)態(tài)光譜測試； |
OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 | 控制功能：控制樣品平移臺移動，通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域， 框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線，實(shí)時生成熒光圖像等 數(shù)據(jù)處理功能：自動對掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù)，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合 （組分?jǐn)?shù)小于等于4），對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖、色表、等高線、截線分析、3D 顯示等 |
操作電腦 | 品牌操作電腦，Windows 10 操作系統(tǒng) |
軟件界面
控制測試界面
測試軟件的界面遵循“All In One”的簡潔設(shè)計(jì)思路，用戶可在下圖所示的控制界面中完成采集數(shù)據(jù)的所有步驟：包括控制樣品平移臺移動，通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域，框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線，實(shí)時生成熒光圖像等。
數(shù)據(jù)處理界面
功能豐富的熒光壽命數(shù)據(jù)處理軟件，充分挖掘用戶數(shù)據(jù)中的寶貴信息?？勺詣訉呙璜@得的FLIM 數(shù)據(jù)，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合（組分?jǐn)?shù)小于等于4），對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示。
自主開發(fā)的一套時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）熒光壽命的擬合算法，可對熒光衰減曲線中多包含4 個時間組分的熒光過程進(jìn)行擬合，獲得每個組分的熒光壽命，光子數(shù)比例，計(jì)算評價函數(shù)和殘差。TCSPC 熒光壽命通常并非簡單的指數(shù)衰減過程，而是與光源及探測器相關(guān)的儀器響應(yīng)函數(shù)（IRF）與熒光衰減過程相互卷積的結(jié)果，因此適當(dāng)?shù)臄M合方法和參數(shù)選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導(dǎo)入實(shí)際測量的IRF 對衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合。但是大多數(shù)情況下， IRF 很難正確的從實(shí)驗(yàn)獲得，針對這種情況，軟件提供了兩種無需實(shí)驗(yàn)獲取IRF 的擬合方法：
1.通過算法對數(shù)據(jù)上升沿進(jìn)行擬合，獲得時間響應(yīng)函數(shù)IRF，然后對整條衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合得到熒光壽命。
2.對于衰減時間遠(yuǎn)長于儀器響應(yīng)時間的，可對衰減曲線下降沿進(jìn)行直接的指數(shù)擬合。該軟件經(jīng)過大量測試，可以很好的滿足各種場合的用戶需求。
MicroLED 微盤的熒光強(qiáng)度像（3D 顯示）：
測試案例
