外泌體是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡，是細(xì)胞間信號傳輸?shù)妮d體。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細(xì)胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升，在2019年自然科學(xué)基金獲批項(xiàng)目中，外泌體研究相關(guān)項(xiàng)目的總數(shù)突破500個，立項(xiàng)的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學(xué)顯微鏡無法對其進(jìn)行成像分析，因此很少有技術(shù)能夠?qū)蝹€外泌體進(jìn)行物理表征和蛋白分型。

　　美國NanoView Biosciences公司推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，采用了獨(dú)特的SP-IRIS成像技術(shù)，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計(jì)數(shù)、粒徑、蛋白表達(dá)、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，目前在全球已近100多個實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻(xiàn)超過200篇。進(jìn)入2022年，使用ExoView發(fā)表的論文出現(xiàn)井噴性增長，短短數(shù)月已經(jīng)發(fā)表了超過94篇。本文選取了2022年的7篇在知名高水平期刊《Journal of Extracellular   Vesicles》發(fā)表的比較有代表性的文章，來說明ExoView在單外泌體亞群分析、血漿、光誘導(dǎo)、神經(jīng)酰胺、3D細(xì)胞培養(yǎng)、心功能不全、新冠疫苗等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。

　　1. 對從T淋巴母細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞釋放的外泌體CD47、整合素和四跨膜蛋白進(jìn)行單外泌體水平綜合分析

　　CD47可調(diào)節(jié)特定編碼和非編碼 RNA 向外泌體的運(yùn)輸，并且CD47+外泌體的RNA含量與從相同細(xì)胞釋放的CD63+外泌體的RNA含量不同。Sukhbir Kaur^[1]等使用ExoView對野生型、 CD47 缺陷型 Jurkat T 淋巴母細(xì)胞系和PC3前列腺癌細(xì)胞系衍生的外泌體的四跨膜蛋白、整合素和CD47進(jìn)行共定位分析。結(jié)果表明在Jurkat細(xì)胞衍生的外泌體上，β1和α4整合素亞基主要與CD47和CD81實(shí)現(xiàn)共定位，沒有與CD63和CD9實(shí)現(xiàn)共定位，驗(yàn)證了早先研究的結(jié)果。此外，PC3細(xì)胞衍生的外泌體很難檢測到α4整合素，但它的CD81與β1、CD47存在特異性關(guān)聯(lián)?？傊?，CD47+外泌體與CD63+、CD9+外泌體不同，它可通過待確認(rèn)的機(jī)制間接調(diào)節(jié)攜帶非相互作用四跨膜蛋白的外泌體豐度。

圖1 ExoView對從 野生型、CD47缺陷型Jurkat T 淋巴母細(xì)胞以及野生型、CD47 缺失型的PC3 前列腺癌細(xì)胞釋放的外泌體進(jìn)行無熒光標(biāo)記和熒光標(biāo)記分析

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　　[1] Sukhbir   Kaur ……& David D. Roberts. (2022) Single vesicle analysis of CD47 association with integrins and tetraspanins on extracellular vesicles released by T lymphoblast and prostate carcinoma cells. Journal of  Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12265.

　　2. 四跨膜蛋白區(qū)分人血清和血漿中不同的外泌體亞群-血漿樣品中血小板外泌體的貢獻(xiàn)

　　早期研究證明從血液中分離外泌體的能力對于將外泌體開發(fā)為疾病的生物標(biāo)志物至關(guān)重要，尤其是從血漿和血清中分離外泌體，但很少有研究系統(tǒng)地比較這些外泌體來源的類型。Nasibeh Karimi^[2]等對確定血漿和血清中不同外泌體亞群的存在進(jìn)行了研究。研究人員采集健康受試者血液，分別用K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血漿，同時(shí)用血清凝塊刺激劑管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和質(zhì)譜等技術(shù)分析分離出的外泌體亞群。結(jié)果表明人類血液中含有多個攜帶不同四跨膜蛋白的外泌體亞群，使用不同的抗凝劑和離心方法，會影響外泌體亞群的分析。

圖2 ExoView檢測從血漿、血清、人肥大細(xì)胞系分離的外泌體的數(shù)量、共定位和粒徑

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　　[2] Nasibeh Karimi ……& Cecilia L?sser. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

　　3. 光誘導(dǎo)免疫功能外泌體的產(chǎn)生

　　基于外泌體的治療方法和疫苗的不斷興起，臨床應(yīng)用劑量規(guī)模的研發(fā)始終是一個巨大的瓶頸。為了克服這樣的障礙，Shaobo Ruan^[3]等開發(fā)了一種簡單直接的方法，通過利用近紫外LED燈（365 nm）的光感應(yīng)來促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌外泌體 (DEV)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，近紫外波長不會損害細(xì)胞生長，使DEV生產(chǎn)率提高了13倍以上，同時(shí)讓DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成為理想的治療平臺。

圖3 ExoView檢測mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性標(biāo)記物的數(shù)量、共定位以及進(jìn)行熒光成像

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　　[3] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles,   https://doi.org/10.1002/jev2.12194.

　　4. 神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在外泌體起源和鞘脂組成中的作用

　　早先研究顯示神經(jīng)酰胺可以誘導(dǎo)外泌體的形成，但神經(jīng)酰胺的調(diào)控機(jī)制還有待確認(rèn)。Simone M. Crivelli^[4]等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (CERT) 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 和接觸位點(diǎn)的多泡核內(nèi)體之間介導(dǎo)神經(jīng)酰胺的非囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，而該過程取決于CERT的PH結(jié)構(gòu)域與核內(nèi)體中PI4KIIα生成的PI4P的相互作用。此外，Tsg101蛋白是運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物 (ESCRT-I) 的一部分，在攜帶神經(jīng)酰胺的 CERT 的 START 結(jié)構(gòu)域和Tsg101蛋白之間形成復(fù)合物，。結(jié)果表明，抑制神經(jīng)酰胺的合成減少了CERT-Tsg101復(fù)合物的形成。CERT的過度表達(dá)會增加外泌體的分泌，而抑制CERT會減少外泌體的形成以及降低外泌體中神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的濃度。

圖4  ExoView對 HPA-12治療組和對照組的外泌體進(jìn)行計(jì)數(shù)以及通過對神經(jīng)酰胺標(biāo)記進(jìn)行熒光成像

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　　[4] Simone M. Crivelli ……& Erhard Bieberich. (2022) Function of ceramide transfer protein for biogenesis and sphingolipid composition of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 11:e12233.

　　5. 用于分離3D細(xì)胞培養(yǎng)衍生外泌體的快速管道

　　外泌體的近期細(xì)胞生物學(xué)研究顯示對3D細(xì)胞培養(yǎng)衍生外泌體的需求不斷增加，因?yàn)樗徽J(rèn)為可以更精確地代表體內(nèi)外泌體。因此，開發(fā)將外泌體從3D細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來的有效且可調(diào)控的方法變得非常迫切。Heikki   Kyykallio^[5]等使用納米原纖維纖維素 (NFC) 支架作為3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，開發(fā)了兩種不同方法的管道，可用于從癌癥球體中分離外泌體。其中，一種分批處理方法可以在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)提高外泌體產(chǎn)量，而另一種收獲方法可實(shí)現(xiàn)外泌體的時(shí)間依賴性收集，將外泌體分析與球體開發(fā)相結(jié)合。這兩種方法都易于快速設(shè)置，并且提高外泌體產(chǎn)量。結(jié)果表明，與在超低吸附培養(yǎng)板上無支架培養(yǎng)相比，NFC方法可進(jìn)行定制化且更易于操作，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的高產(chǎn)量。

圖5 ExoView檢測使用NFC的3D細(xì)胞培養(yǎng)衍生的外泌體，統(tǒng)計(jì)各捕獲位點(diǎn)的外泌體數(shù)量以及進(jìn)行熒光成像

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　　[5] Heikki Kyykallio ……& Pia R-M Siljander. (2022) A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12273.

　　6. 含miR-421的外泌體與空氣污染（PM2.5）誘導(dǎo)心功能不全的發(fā)生機(jī)制相關(guān)

　　大氣細(xì)顆粒物（PM2.5，空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm）是空氣污染的主要原因。越來越多的證據(jù)表明，大氣PM2.5濃度的升高與總死亡率呈正相關(guān)，尤其是心血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率。   PM2.5急性/亞急性暴露對人體的危害不容忽視，但是對于呼吸系統(tǒng)亞急性暴露于PM2.5所誘發(fā)心臟功能不全的分子機(jī)制尚不完全清楚。上海大學(xué)王紅云^[6]等在大氣污染相關(guān)的心血管疾病研究方面取得新進(jìn)展，揭示了大氣PM2.5亞急性暴露引發(fā)心功能不全的新的分子機(jī)制：大氣PM2.5亞急性暴露在肺損傷后促進(jìn)外泌體釋放其攜帶的miR-421，通過抑制ACE2導(dǎo)致   PM2.5誘導(dǎo)的心功能不全。

圖6  ExoView檢測從暴露于PM2.5的細(xì)胞上清液提取的外泌體和對照組外泌體的計(jì)數(shù)、粒徑以及進(jìn)行熒光成像

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　　[6] Hongyun Wang ……& Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppresses air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signalling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.

　　7. 基于細(xì)菌外泌體的新型新冠疫苗對疾病的保護(hù)作用

　　自從新冠疫情爆發(fā)以來，有多種不同技術(shù)路線的疫苗在全世界的抗疫中發(fā)揮了重大作用。然而現(xiàn)有的疫苗有諸如穩(wěn)定性、保存、反應(yīng)速率、產(chǎn)量等問題，而且病毒變種如Delta的流行，進(jìn)一步降低了疫苗的保護(hù)效率，需要疫苗技術(shù)的突破來克服。Jiang和Driedonks^[7]等通過在細(xì)菌的外泌體表面修飾病毒S蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）制成了新型新冠疫苗。革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)生外膜囊泡（OMV），在哺乳動物體內(nèi)具有免疫刺激作用，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生并刺激樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，而經(jīng)過改造的工程菌能夠產(chǎn)生降低了內(nèi)毒性的OMV。

圖7 ExoView對RBD-OMV組以及對照組的外泌體的表型進(jìn)行無熒光標(biāo)記和熒光標(biāo)記分析

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　　[7] A bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type and Delta variants.

　　在上述7篇文章中，科學(xué)家借助美國NanoView Biosciences公司研發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結(jié)果直接輸出外泌體粒徑，數(shù)目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。7篇文章分別從單外泌體亞群分析、血漿、光誘導(dǎo)、神經(jīng)酰胺、3D細(xì)胞培養(yǎng)、心功能不全、新冠疫苗等研究領(lǐng)域介紹了ExoView的無需純化，全面表征的特點(diǎn)，有力地證明ExoView是外泌體檢測的一大利器。

　　為了更好的服務(wù)中國客戶，Quantum Design中國子公司在北京建立了專業(yè)的客戶服務(wù)中心，正式推出專業(yè)的全面外泌體表征測試服務(wù)，您只需要極少量樣品即可獲得全面的外泌體表征數(shù)據(jù)：

　　服務(wù)推出至今，短短兩年已經(jīng)助力多個單位客戶發(fā)表高水平文獻(xiàn)：

　　? 上海大學(xué)在《Journal of extracellular vesicles》發(fā)表文章。

　　? 中國科學(xué)院深圳技術(shù)研究院在《Lab on a Chip》發(fā)表文章。

　　?  北京天壇醫(yī)院、納米科學(xué)中心、北京航空航天大學(xué)在《Advanced Science》發(fā)表文章。

　　?同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)在《Journal of Nanobiotechnology》發(fā)表文章。

　　? 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS》發(fā)表文章

　　? 南京大學(xué)在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》發(fā)表文章

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