磁珠是何方神圣？ 如何慧眼識“珠”？
生物磁珠一般是具有細(xì)小粒徑 (μm) 的超順磁微球。具有以下特點：
1) 極強順磁性，在磁場中能夠迅速聚集，離開磁場后又能均勻分散；
2) 合適且均一的粒徑，保證其具有足夠強的磁響應(yīng)性又不會沉降；
3) 豐富的表面活性基團(tuán)，以便和生物分子偶聯(lián)，并在外磁場的作用下實現(xiàn)與被待測樣品的分離。
圖 1. MCE 磁珠組成
A、G、L、A/G 代表 Protein A、Protein G、Protein L 及 Protein A/G；
Anti-HA、Anti-Flag、Anti-c-Myc、Anti-GST 代表 Anti-HA 抗體、Anti-Flag 抗體、Anti-c-Myc 抗體及 Anti-GST 抗體
選磁珠時，首先關(guān)注磁珠磁性 (磁吸時間)、粒徑 (大小及均一度) 等。其次根據(jù)實驗?zāi)康模x擇合適的表面活性基團(tuán)以及由此衍生的偶聯(lián)方式、蛋白結(jié)合量等。
比如，如果您的目標(biāo)蛋白帶有融合標(biāo)簽，可一步到位選擇：
·Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201)
·Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207)
·Anti-c-Myc Magnetic Beads (HY-K0206)
·Anti-GST Magnetic Beads (HY-K0222)
如果您的目標(biāo)蛋白帶有生物素標(biāo)記，可選擇
·Streptavidin Magnetic Beads (HY-K0208)
如果您有可識別靶蛋白的抗體，可選擇
·Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202)
·Protein A Magnetic Beads (HY-K0203)
·Protein G Magnetic Beads (HY-K0204)
·Protein L Magnetic Beads (HY-K0205)
下面以 Protein A/G磁珠為例，詳述 IP 實驗步驟、可能存在的問題及解決方法。
■ Step 1——抗原樣品制備
制備抗原樣品 (細(xì)胞裂解物) 是 IP 的一步，也是關(guān)鍵的一步。正確的細(xì)胞裂解液可以穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)構(gòu)象、抑制酶活性、很大限度地減少抗體結(jié)合位點變性并釋放細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)。一般可選 NP-40、RIPA、Western 及 IP 細(xì)胞裂解液等。抗原樣品應(yīng)始終保存在冰上，并將蛋白酶抑制劑添加到裂解液中以防止蛋白水解。
注 1：Co-IP 實驗時，常用 NP-40 等非離子型裂解液，以免破壞蛋白-蛋白相互作用。
注 2：確保目的蛋白在抗原樣品中有較高水平表達(dá)。
圖 2. 培養(yǎng)、收集、裂解細(xì)胞，釋放靶蛋白
■ Step 2——樣本結(jié)合
通過此步驟，您將獲得磁珠—抗體—抗原樣品復(fù)合物。磁珠、抗體、抗原樣品的加樣順序?qū)Π械鞍椎寐视幸欢ㄓ绊憽?/p>
圖 3. 常見 IP 實驗的樣本結(jié)合步驟
All in one——直接將磁珠、抗體、抗原樣品混合到一起；
直接結(jié)合——抗體和磁珠先結(jié)合，再和抗原樣品結(jié)合；
間接結(jié)合——抗體和抗原樣品先結(jié)合，再和磁珠結(jié)合。
可選步驟 1——抗原樣品預(yù)處理：為減少非特異性結(jié)合，可將抗原樣品單獨與 Protein A/G 磁珠或同型對照抗體結(jié)合。
(預(yù)處理有助于去除在 IP 過程中可能與抗體或磁珠非特異性結(jié)合的分子，從而改善信噪比。)
可選步驟 2——抗體的交聯(lián)固定：如果不希望抗體與目標(biāo)蛋白共洗脫，可在直接結(jié)合時，使用交聯(lián)劑將抗體共價連接到 Protein A/G 上。后續(xù)使用酸性洗脫法洗脫靶蛋白。
(直接將磁珠、抗體、抗原樣品混合到一起，速度極快，但獲得的靶蛋白純度和得率會很低；間接結(jié)合靶蛋白得率較高，但在洗脫步驟時，抗體會和靶蛋白一起被洗脫；直接結(jié)合，蛋白得率也較高，且可通過交聯(lián)固定抗體，達(dá)到單獨洗脫靶蛋白的目的。)
一般情況下，如果靶蛋白豐度較高，直接結(jié)合與間接結(jié)合差別不大，均可選；如果靶蛋白豐度不高，可選間接結(jié)合以獲得更高的靶蛋白得率。
樣本結(jié)合步驟中的結(jié)合/洗滌緩沖液也非常重要。一般情況下，您的結(jié)合/洗滌緩沖液可以為同一種緩沖液，如 TBST/PBST。另外可通過加入去垢劑 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加鹽離子濃度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗滌次數(shù)等來提高洗雜效率。
■ Step 3——抗原洗脫
一般根據(jù)下游應(yīng)用選擇洗脫方法：
圖 4. 常見抗原洗脫方法
1) 變性洗脫法：如果下游分析是用免疫印跡 (Western Blot)，則通常直接使用 SDS-PAGE Loading Buffer 進(jìn)行洗脫 (95°C 加熱 5 mins)。該緩沖液可使蛋白質(zhì)變性還原并用于電泳，十分有效，適用于親和作用的解離。但該方法也會洗脫下抗體等非靶分子，且獲得的蛋白不具備生物活性。
2) 酸性洗脫法：0.1 M-0.15 M 甘氨酸 (pH 2.5-3) 是 IP 中較高效的非變性洗脫緩沖液，低 pH 水平可以解離大多數(shù)抗體-抗原相互作用。此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。但酸性洗脫不是全能方法，采用該緩沖液可能無法解離某些抗體—抗原相互作用，而且部分抗體對低 pH 環(huán)境敏感。
注 1：在洗脫前的接收管中提前加入中和液，可緩解抗體對于低 pH 環(huán)境的敏感。
注 2：低 pH 水平也可以解離未交聯(lián)情況下的抗體—Protein A/G 相互作用。如果不希望抗體與靶蛋白共洗脫，可在樣本結(jié)合步驟時，使用交聯(lián)劑將抗體共價連接到 Protein A/G 上。而后再用酸性洗脫法洗脫靶蛋白。
3) 競爭性洗脫法：如果靶蛋白帶有標(biāo)簽，可用高濃度標(biāo)簽或配體進(jìn)行競爭性洗脫。如 Flag 標(biāo)簽蛋白，可用3×Flag peptide 競爭性洗脫，此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析，而且還沒有抗體片段污染。
■ Step 4——WB 驗證
設(shè)計好實驗，優(yōu)化好條件，配好各種 buffer 和工作液，按照 protocol，小心翼翼的絲毫不敢怠慢，一通操作猛如虎，一看結(jié)果。
1) 靶蛋白信號微弱或無信號
靈魂五問：蛋白表達(dá)了嗎？上樣量足夠嗎？孵育時間充足嗎？裂解液選的合適嗎？洗脫方法合適嗎？
圖 5. IP 組信號微弱或無信號，Input 組有條帶，IP 組沒條帶或條帶很弱
解決方案詳戳 “冬風(fēng)吹，戰(zhàn)鼓擂，蛋白純化，我怕誰！
2) 高背景值或多條帶
a. 優(yōu)化蛋白上樣量，IP 時總蛋白上樣量過多可能會造成非特異性結(jié)合，建議上樣量為 1 mg 左右；蛋白電泳時，優(yōu)化上樣量以觀察特定信號；
b. 優(yōu)化洗滌緩沖液，通過向洗滌緩沖液中加入去垢劑 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加鹽離子濃度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗滌時間、洗滌次數(shù)等降低背景；
c. 非必需的高強度洗脫緩沖液 (如 SDS-PAGE 上樣緩沖液) 將導(dǎo)致多種非特異蛋白 (如Protein A/G 或鏈霉親和素亞基) 與抗原一起被共洗脫下來。溫和的緩沖液 (如 0.1 M 甘氨酸，pH 2.5) 可以防止此類污染；
d. 抗體污染問題：參考前面關(guān)于抗體交聯(lián)固定的討論或使用不同種屬的一抗進(jìn)行 IP 和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測；
e. 使用恰當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?，防止蛋白降解?/p>
f. 對抗原樣品預(yù)處理 (將抗原樣品單獨與 Protein A/G 磁珠或同型對照抗體結(jié)合)，可減少部分非特異性結(jié)合。
3）陽性及陰性對照設(shè)置
成功的條帶總是相似的，失敗的條帶各有各的不同。分析結(jié)果時，有陰性、陽性對照能一步到位幫您分析原因。
陽性對照：證實細(xì)胞裂解物中確實存在靶蛋白 (IP) 或者互作蛋白對 (Co-IP，比如誘餌蛋白 X 和靶蛋白 Y)，即為常說的 input。可直接使用細(xì)胞裂解物或者抽提好的蛋白溶液進(jìn)行 Western Blot。
陰性對照：IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白對都檢測到了，固然是值得高興的，但是這結(jié)果是不是假陽性呢？還得做個陰性對照。例如，同型對照抗體 (沒有特異靶標(biāo)的一抗，但在類別和亞型上，其跟實驗應(yīng)用中的靶標(biāo)一抗一致) 等。
Output：在某些 Co-IP 實驗中，實驗人員會把 IP 后的上清分別進(jìn)行誘餌蛋白 X 和靶蛋白 Y 的 WB 檢測，該對照組稱為 output 組。
......
好了，說了這么多，希望本篇對大家有所幫助，?；锇閭兡玫叫膬x的實驗結(jié)果。
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