研究背景：
FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白家族中，黏著斑蛋白（kindlin）和踝蛋白（talin） 是進(jìn)化上高度保守并且在FERM結(jié)構(gòu)域中表現(xiàn)出高度同源性。kindlin家族在整合素（integrin）活化中發(fā)揮重要作用，參與integrin的雙向信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)整合素受體介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、細(xì)胞遷移、胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外kindlin的異常還可以導(dǎo)致多種遺傳性疾病的發(fā)生，同時(shí)kindlin家族作為重要的信號(hào)分子還參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
近日，《Nature Communications》刊登了Grégory Giannone等學(xué)者的新研究成果，該團(tuán)隊(duì)使用Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)SAFe 360的超分辨-單分子追蹤技術(shù)（SPT-PALM）研究了kindlin和talin等蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜中的擴(kuò)散機(jī)制。
研究?jī)?nèi)容：
焦點(diǎn)黏著斑蛋白（FAs）家族廣泛參與整合素依賴型細(xì)胞粘附、性和遷移等過(guò)程，通過(guò)直接或間接的方式結(jié)合在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間，并與具有不同結(jié)構(gòu)、信號(hào)或支架功能的蛋白建立物理聯(lián)系。然而FAs蛋白如何被引導(dǎo)到特定的納米層以促進(jìn)與特定靶點(diǎn)的相互機(jī)制目前尚不清楚。為探究其機(jī)制，Grégory Giannone等將kindlin的蛋白分子行為和3D納米定位與其在FAs內(nèi)integrin激活中的功能聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)單蛋白追蹤、超分辨成像以及功能分析kindlin在上膜的定位和擴(kuò)散對(duì)integrin激活、細(xì)胞擴(kuò)散和FAs形成過(guò)程，并通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)kindlin通過(guò)與talin不同的途徑來(lái)達(dá)到和激活integrin，為integrin激活期間的互補(bǔ)性提供了可能的分子基礎(chǔ)。
先，作者通過(guò)追蹤integrin在細(xì)胞中不同區(qū)域的單分子運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算單個(gè)β1-integrin或者β3-integrin分子的擴(kuò)散系數(shù)，并比較integrin在FA內(nèi)和FA外的擴(kuò)散系數(shù)，發(fā)現(xiàn)integrin在FA中有自由擴(kuò)散（綠色軌跡），被束縛的區(qū)域擴(kuò)散（黃色軌跡）和固定不動(dòng)三種不同模式。不同的細(xì)胞中，integrin在FA外普遍表現(xiàn)出更快的擴(kuò)散速度，更多傾向于純自由擴(kuò)散。同時(shí)Mn2+的處理會(huì)讓更多的integrin分子傾向于固定不動(dòng)，也即參與同kindlin和或talin相互作用。經(jīng)過(guò)計(jì)算kindlin突變體和talin突變體中β1-integrin或者β3-integrin的擴(kuò)散系數(shù)并比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)于這兩個(gè)突變體，Mn2+處理結(jié)果略有不同，kindlin突變體中integrin分子傾向于固定不動(dòng)的比例相對(duì)于talin突變體較低一些。
integrin，kindlin和talin在細(xì)胞中的擴(kuò)散的軌跡分布于擴(kuò)散系數(shù)分布
為了進(jìn)一步分析kindlin和talin與integrin相互作用的機(jī)制，觀測(cè)比較kindlin和talin單分子擴(kuò)散軌跡可發(fā)現(xiàn)integrin和kindlin通過(guò)細(xì)胞膜自由擴(kuò)散立進(jìn)入焦點(diǎn)黏著斑（FAs），而talin和paxillin通過(guò)胞漿自由擴(kuò)散到達(dá)FAs。在FAs中integrin展現(xiàn)自由擴(kuò)散和被束縛的擴(kuò)散兩種擴(kuò)散模式，兩種模式都是通過(guò)kindlin和talin的結(jié)合觸發(fā)。自由擴(kuò)散時(shí)integrin，kindlin和talin同時(shí)以正確的取向結(jié)合的概率非常低，Grégory Giannone等學(xué)者研究顯示三者更傾向于如上圖所示的模型，也即在質(zhì)膜上自由擴(kuò)散的integrin和kindlin會(huì)先形成不可移動(dòng)的integrin-kindlin復(fù)合物(i)；這種復(fù)合物可以限制整合素β端的方向，并有利于talin與近端NPxY基序的結(jié)合，從而形成短暫integrin-kindlin-talin的三元復(fù)合物(ii)；kindlin可以間歇性地解離(iii)并再次(ii)與壽命更長(zhǎng)的integrin-talin復(fù)合物重新結(jié)合。這種瞬態(tài)的integrin-kindlin-talin三元復(fù)合物的相互作用會(huì)大大延長(zhǎng)integrin和talin的相互作用的持續(xù)時(shí)間。talin和kindlin脫附后integrin會(huì)繼續(xù)恢復(fù)自由擴(kuò)散的模式，直至再次和kindlin結(jié)合。
kindlin和talin激活整合素的示意圖模型
實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)介：
本實(shí)驗(yàn)中實(shí)用的單分子示蹤系統(tǒng)是abbelight公司研發(fā)的3D單分子定位顯微系統(tǒng)—SAFe 360，利用其特有的DAISY技術(shù)將xyz方向的定位精度提高至15 nm，可以觀測(cè)蛋白顆粒的定位分布及其運(yùn)動(dòng)軌跡。除此之外，該設(shè)備還具備大視場(chǎng)和一鍵式操作，能夠大幅度降低單分子定位操作技術(shù)的門檻，幫助研究者從事分子機(jī)制的研究。
典型采集實(shí)例：
| 神經(jīng)元超分辨成像 | 大腸桿菌 | 線粒體三維結(jié)構(gòu) | 外泌體成像 |
參考文獻(xiàn)：
[1] Orré, Thomas, et al. "Molecular motion and tridimensional nanoscale localization of kindlin control integrin activation in focal adhesions." Nature communications12.1 (2021): 1-17.
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1. 3D單分子熒光成像系統(tǒng)-SAFe 360
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2. 大視野單分子超分辨模塊-SAFe 180
