1． 重組蛋白分類
A.按蛋白分類 | B.按種屬分類 |
a. 細胞因子 (Cytokines) | a. 人 (Human) |
b. 生長因子 (Growth Factors) | b. 小鼠 (Mouse) |
c. 趨化因子 (Chemokines) | c. 大鼠 (Rat) |
d. 激素 (Hormones) | d. 猴 (Rhesus Macaque) |
e. 神經(jīng)營養(yǎng)因子 (Neurotrophins) | e. 豬 (Porcine) |
f. 酶 & 酶抑制劑 (Enzymes & Inhibitors) | f. 狗 (Canine) |
g. 其他 (Others) | g. 牛 (Bovine) |
B. 按種屬分類 | h. 其他(Others) |
2．重組蛋白表達體系
MCE 重組蛋白表達體系主要有：大腸桿菌，酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物
細胞。
3．重組蛋白純度和濃度測定
重組蛋白純度測定方法：a. SDS-PAGE 測定法；b. HPLC 測定法；c. 銀染測
定法。
重組蛋白濃度測定方法：a. Bradford 蛋白定量測定法；b. BCA 蛋白定量測
定法；c. SDS-PAGE 蛋白定量測定法。
4．重組蛋白運輸狀態(tài)
MCE 的大部分重組蛋白產(chǎn)品為凍干粉，在室溫環(huán)境中都是穩(wěn)定的，一般采用
藍冰或是室溫運輸。
5．重組蛋白表達體系對比
表達體系 | 優(yōu)缺點 |
原核體系 | 繁殖快、成本低，產(chǎn)量高，但不能進行糖基化修飾，常為包涵體 |
哺乳動物細胞 | 結(jié)構(gòu)與天然蛋白最接近，完善的翻譯后加工，活性更好，但表達水平較低，周期長，技術(shù)要求高 |
酵母細胞 | 易操作，蛋白背景弱，適合大規(guī)模生產(chǎn)，便于純化，但存在產(chǎn)量不高以及糖基化達不到要求等問題 |
昆蟲細胞 | 功能與天然蛋白相似，對于部分有毒性或較難表達蛋白有優(yōu)勢，但糖基化程度低，形式比較單一，活性不如哺乳動物細胞表達系統(tǒng) |
6．重組蛋白表達體系選擇
研究目的 | 蛋白要求 | 最適表達系統(tǒng) |
用作抗原，獲得特異性抗體 | 純度>80%，不需要蛋白修飾或天然活性，可帶標簽 | 原核表達體系 |
用于檢測蛋白質(zhì)結(jié)晶及晶體結(jié)構(gòu)研究 | 純度>95%，濃度通常在 10 mg/mL | 2/3 是原核表達體系，1/3 是昆蟲細胞表達體系與哺乳動物細胞表達體系 |
蛋白的功能研究 | 需要保存蛋白的天然活性 | 原核表達體系和真核表達體系 |
用于藥物研究的蛋白質(zhì) | 一般要求盡量保存天然序列，具有天然活性 | 真核表達體系 |
7重組蛋白開蓋使用前處理
為防止凍干粉產(chǎn)品的粉末沾在管壁或管蓋上，使用前請勿開蓋，離心(約
13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保
證每管產(chǎn)品的蛋白總量達到標示含量。
8．重組蛋白復溶
a. 使用前先離心(約 13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白
收集于管底。
b. 嚴格依據(jù)說明書，使用推薦的溶液將蛋白凍干粉溶解至推薦的濃度。大
多數(shù)重組蛋白建議溶解在滅菌超純水中，濃度不低于 100 μg/mL，以便于
后續(xù)進一步稀釋至工作濃度。
c. 用移液槍輕吹混勻，或?qū)⒐苌w蓋好后輕柔顛倒數(shù)次進行混勻，低速離心
數(shù)秒。
d. 復溶后的重組蛋白在室溫放置數(shù)分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。
9.重組蛋白儲存
由于每次凍融都會造成蛋白的部分變性，因此建議客戶收到產(chǎn)品后適量分
裝避免反復凍融。
a. 短期儲存：
凍干粉狀態(tài)產(chǎn)品在室溫下存放 3 周，不影響活性。
復溶后的產(chǎn)品在 4℃ 可穩(wěn)定儲存 1-2 周。
b. 長期儲存：
凍干粉狀態(tài)產(chǎn)品在 -20℃ 下，可穩(wěn)定保存至少一年；推薦 -80℃ 長期保存，
以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
可選擇包含一定濃度載體蛋白(0.1% BSA， 5% HSA， 10% FBS，或 5% 海
藻糖)的溶液或培養(yǎng)基復溶產(chǎn)品，分裝后凍存于 -20℃ 下，可保存至少三個
月；推薦 -80℃ 長期保存，以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
注：分裝凍存時，蛋白濃度不低于 100 ng/μL，且每管的體積不可小于 20
μL。
10．載體蛋白介紹
載體蛋白主要用于提升重組蛋白復溶后的穩(wěn)定性，同時也有利于避免產(chǎn)品
粘附在管壁上。例如：HSA, BSA。
11.重組蛋白標簽影響
蛋白標簽指重組蛋白制備過程中與目的蛋白融合表達的蛋白或多肽。MCE
的重組蛋白產(chǎn)品大部分為無標簽狀態(tài)，但少數(shù)重組蛋白產(chǎn)品因為不同目的
需要加有標簽。
a. 標簽利于蛋白純化。
b. 當目的蛋白無特定抗體直接鑒定，可利用標簽進行 Western Blot 或
ELISA 分析方法鑒定。
c. Fc 標簽可以提升重組蛋白的半衰期以提高分子的穩(wěn)定性，同時也能夠促
進重組蛋白形成活性二聚體。
重組蛋白標簽對蛋白的生物學活性影響存在未知結(jié)論，但對大部分檢測應(yīng)
用中，重組蛋白的標簽對蛋白本身生物學活性并無影響，所以無需移除。
MCE 對重組蛋白產(chǎn)品都已經(jīng)做過生物學活性檢測并將數(shù)據(jù)公示于 COA 中。
12.重組蛋白活力值與計算方法
MCE 重組蛋白的生物學活性 (ED50) 測定數(shù)據(jù)在 COA 中可以獲得。ED50 是
Effective Dose 50 的縮寫，是可誘導 50% 最大反應(yīng)的蛋白濃度 (ng/mL)。
計算公式如下:
MCE 的重組蛋白產(chǎn)品并未采用 WHO (National Institute for Biological
Standards and Control) 設(shè)定的標準來測定活力值，以上計算公式并不適
用于“International Units”和“ED50”的轉(zhuǎn)換關(guān)系，需要采用國際標準品
對比相同實驗獲得該重組蛋白的 IU 值。
13.重組蛋白 ED50 值的批間差
不同批次的產(chǎn)品或不同實驗方法的測定都會導致重組蛋白產(chǎn)品的 ED50 值變
化，我們推薦客戶根據(jù)自己的實驗測定得到最合適的實際 ED50 值。
14.重組蛋白應(yīng)用方案
MCE 重組蛋白產(chǎn)品的 COA 中顯示的實驗方案只是確認該產(chǎn)品的 ED50 值，
但并不與終端客戶的不同類型實驗結(jié)果存在等效性。如果客戶需要應(yīng)用在
不同于本公司產(chǎn)品測試的實驗方法時，我們建議客戶通過實際測試獲得最
佳 ED50 值。
15.重組蛋白的種屬交叉活性
重組蛋白的種屬交叉活性需要根據(jù)具體產(chǎn)品而定；建議盡量選擇對應(yīng)種屬
的重組蛋白。如實在無法匹配種屬，以下信息供參考：
a. 大多數(shù)人細胞因子對小鼠細胞有效 (僅少數(shù)例外)。
b. 多數(shù)小鼠細胞因子對人細胞有效，但特異性可能不強。如小鼠的表皮生
長因子(EGF)對人的表皮細胞有活性，對人的其他種類細胞可能也有作用。
c. 干擾素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有種屬特異性，即重組人的這些細胞因
子只能作用于人細胞，對小鼠和大鼠等其他種而重組小鼠的這些細胞因子
也僅用于小鼠，對人的細胞無效。
d. 成纖維細胞生長因子 (FGFs)、神經(jīng)營養(yǎng)素 ( Neurotrophins，如 BDNGF、
GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各種屬間交叉活性強。
