酵母基因組DNA提取試劑盒
Yeast DNA Kit
●試劑盒內(nèi)容及保存：
試劑盒組成 | RTG2409 （50次） | 貯存方式 |
緩沖液YL | 13 ml | 常溫 |
緩沖液YBL | 13 ml | 常溫 |
緩沖液SE | 15 ml | 常溫 |
DNA Wash Buffer(濃縮液) | 13 ml | 常溫 |
緩沖液WB | 30 ml | 常溫 |
洗脫緩沖液EB | 15 ml | 常溫 |
蛋白酶K | 1 ml | -20℃ |
Lyticase | 1.6 ml | -20℃ |
RNaseA | 0.5 ml | -20℃ |
Glass Beads | 3 g | 常溫 |
吸附柱CG | 50個 | 常溫 |
收集管（2 ml） | 50個 | 常溫 |
說明書 | 1份 |
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●儲存條件和效期：
室溫保存，12個月內(nèi)有效。Proteinase K與Lyticase-20℃保存。緩沖液 YBL與緩沖液 YL可能有沉淀產(chǎn)生，37度水浴溶解后即可。
●產(chǎn)品簡介：
酵母DNA提取試劑盒(Yeast DNA Kit)采用了一種新型的硅膠柱。在特定條件下，使DNA能在離心過柱的瞬間，結合到純化柱上，在一定條件下又能將DNA充分洗脫，從而實現(xiàn)DNA的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀。純化的DNA可直接用于PCR、Southern雜交和酶切等。
●準備工作：
1. 準備30℃，65℃，70℃水??；無水乙醇；制冰機；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照標簽所示在DNA Wash Buffer中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>
3. 每次使用前請檢查緩沖液YBL，緩沖液YL是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
●標準操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1. 取1-3 ml 酵母培養(yǎng)物（不超過3×107酵母細胞），12,000 rpm (~13,400×g )離心1分鐘，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
注：可用分光光度計或平板培養(yǎng)法檢測菌體量，一般對于釀酒酵母OD600值為1.0時，相當于1-2×107cell/ml。
2. 加入480 μl 緩沖液 SE，完全重懸細胞。加入30μl Lyticase溶液。30℃水浴處理30min。期間振蕩幾次。
注意：以處理時間為經(jīng)驗值，根據(jù)酵母菌株和酵母細胞數(shù)量的不同，孵育時間應該進行適當調整。
3. 4000 rpm(~1500×g)離心10鐘，棄上清，收集沉淀。加入200μl 緩沖液 YL重懸。加入50mg Glass Beads，劇烈渦旋5min。
4. 加入20μl 蛋白酶K，混勻。65℃水浴孵育直至裂解完全，孵育過程中，渦旋幾次。一般來說1小時以內(nèi)能徹底裂解。
5. 可選步驟：加入5μl RNaseA并反復顛倒混勻，在室溫條件下孵育5分鐘。
6. 12,000 rpm (~13,400×g )離心1分鐘，轉移上清至新的離心管中。
7. 加入220 μl 緩沖液YBL，振蕩15 秒，70℃放置10 分鐘，溶液應變清亮。
注意：加緩沖液YBL 時可能會產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置時會消失，不會影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA量少和提取出的DNA不純。
8. 加220 μl 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
9. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μl 緩沖液 WB，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。
11. 向吸附柱 中加入600 μl DNA Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。
12. 向吸附柱中加入600 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。
13. 12,000 rpm(~13,400×g)離心2 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
14. 將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μl 洗脫緩沖液EB或滅菌去離子水，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1分鐘，將溶液收集到離心管中。
注：洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH 值調到此范圍)，pH 值低于7.0 會降低洗脫效率；
15. DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防DNA降解。
●DNA濃度及純度檢測：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應在23kb以上。使用分光光度計檢測時，OD260/OD280比值應為1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
●常見問題分析：
常見問題 | 可能原因 | 建議 |
堵柱子 | 樣品量太多，裂解不完全，樣品太粘稠 | 降低樣品量； 延長Lyticase酶解時間； 延長加入緩沖液YBL和蛋白酶后的裂解放置時間 |
低濃度的DNA量 | 柱子堵塞 | 見上 |
DNA殘留在柱子上 | 增加洗脫液的用量，并在離心洗脫前將洗脫液EB65℃孵育5min。 | |
DNA洗滌不當 | DNA Wash Buffer按說明書用無水乙醇稀釋。 | |
下游應用不好 | 提取的DNA含鹽量高 | DNA Wash Buffer如果必須按要求用無水乙醇稀釋，必須室溫放置。 |
提取的DNA含有乙醇 | 洗脫前，必須最高轉速空甩柱子1min。 |
