Greiner凍存管安全使用須知
凍存管使用不當(dāng)， 會(huì)有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險(xiǎn)凍存管使用不當(dāng)， 會(huì)有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險(xiǎn)凍存管使用不當(dāng)，會(huì)有爆、生物安全威脅及人身傷害等風(fēng)險(xiǎn)
細(xì)胞凍存流程 細(xì)胞凍存流程
用預(yù)熱過(guò)的 PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，棄去 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，棄去 PBS 后，加入含 后，加入含 后，加入含 EDTAEDTAEDTAEDTA的胰酶消 化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消(薄地覆蓋表面即可，濃度須 化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消(薄地覆蓋表面即可，濃度須 化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消(薄地覆蓋表面即可，濃度須 根據(jù)不同的細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)整)。 根據(jù)不同的細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)整)。
37 ℃消化 細(xì)胞 3–5分鐘，不可過(guò)度消化。
一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化并吸管輕吹 打以重懸細(xì)胞 。
離心( 500 00 00 × g, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 min)細(xì)胞重懸液以沉淀， )細(xì)胞重懸液以沉淀， 棄上清， 用含血清培養(yǎng) 基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸。
對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(推薦 Neubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamber Neubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamberNeubauer chamber)。
離心( 500 500 500 500 × g, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 ming, 5 min)細(xì)胞重懸液，棄上清。用適當(dāng)體積含血培養(yǎng)基 )細(xì)胞重懸液，棄上清。用適當(dāng)體積含血培養(yǎng)基 重懸細(xì)胞。
將細(xì)胞重懸液以 1:11:1 比例與凍存液( 比例與凍存液( 60% 培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基， 20% FCS20% FCS20% FCS 20% FCS 20% FCS，20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO20% DMSO) 進(jìn)行混合后轉(zhuǎn)移至 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管中。細(xì)胞的濃度應(yīng)為 1–5 × 10 6 細(xì)胞 /ml 。
含有細(xì)胞的凍存管須按照 .1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min1 K/min的冷卻速率進(jìn)行凍。將存管插在 的冷卻速率進(jìn)行凍。將存管插在 的冷卻速率進(jìn)行凍。將存管插在 含異丙醇的凍存 盒小室并放置在 .70 ℃的冰箱中可以實(shí)現(xiàn)上述要求。如果 的冰箱中可以實(shí)現(xiàn)上述要求。如果 的冰箱中可以實(shí)現(xiàn)上述要求。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時(shí)，則需要將 凍存液中含有其他類型的樣品時(shí)，則需要將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管在 .20 ℃， .70 ℃或者液氮的氣相層進(jìn)行 直接 凍存。為確保每個(gè)樣品的均一效 果， 4 ml 和 5 ml 的 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管需在 .20 ℃過(guò)夜凍存后再轉(zhuǎn)移至 70 ℃ 或者液氮的氣 相層。
然后將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考 慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求，建議將 慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求，建議將 Cryo.sCryo.sCryo.s Cryo.sCryo.sTM 凍存管放置在 液氮上方的氣 相層而非液氮。
細(xì)胞復(fù)蘇流程
從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于37℃水浴中進(jìn)行解凍，解凍時(shí)間約1–2min，解凍時(shí)需要不停搖動(dòng)凍存管令其盡快融化。此步解凍過(guò)程越快越好。
將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。
離心(500 ×g, 5 min)細(xì)胞重懸液，棄去上清。用適當(dāng)體積的含血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸后分裝到1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
請(qǐng)遵循細(xì)胞接種時(shí)的推薦濃度進(jìn)行培養(yǎng)。
接下來(lái)的12個(gè)小時(shí)細(xì)胞需要靜置培養(yǎng)。
細(xì)胞換液可在24–48h后進(jìn)行。
Cryo.sTM凍存管安全使用建議
使用凍存管儲(chǔ)存樣本時(shí)，嚴(yán)格要求應(yīng)把凍存管放入液氮的氣相層或冰箱中保存!如果凍存管儲(chǔ)存于液氮液體中，液氮有一定幾率會(huì)滲入凍存管內(nèi)部，復(fù)蘇時(shí)液氮?dú)饣瘜?dǎo)致管內(nèi)外壓力不平衡，這樣極易造成凍存管的炸裂，并具有生物危害性。
操作凍存管復(fù)蘇，全程使用安全防護(hù)設(shè)備，建議穿實(shí)驗(yàn)服、戴棉質(zhì)手套且在安全的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行操作。條件允許情況下，請(qǐng)佩戴護(hù)目鏡或防護(hù)面罩。由于夏季室內(nèi)溫度會(huì)高于冬季，請(qǐng)格外小心。
凍存細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中，凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會(huì)導(dǎo)致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會(huì)抑制兩側(cè)的液體溫度傳遞進(jìn)而產(chǎn)生危險(xiǎn)的高壓力并導(dǎo)致凍存管受損。
凍存的樣本量不要超過(guò)凍存管要求的最大工作體積。
