常規(guī)病理HE制片技術(shù)疑難解答及注意事項
一、常規(guī)病理HE制片疑難解答
1、為何組織脫水處理要從低濃度開始?
答：乙醇是無色、透明、易燃及親水性的液體，易混合于其他有機溶液，脫水快速可靠，各級濃度乙醇均可用于脫水。如果用乙醇進行脫水處理，起始濃度最好為70%乙醇水溶液，隨后是95%乙醇和100%無水乙醇。對特別易破碎的組織標本，推薦脫水處理時使用的乙醇起始濃度為30%乙醇。高濃度乙醇脫水，易于在組織外圍形成硬化，俗稱“極化”，阻礙固定液的滲透，影響組織的正常脫水。故組織脫水正確的做法是從低濃度乙醇開始，循序漸進。特殊需要除外。
2、如何防治或減少組織切片空洞?
答：此種情況，不僅影響切片的美觀，更主要的是易給病理醫(yī)生的診斷造成遺漏。如果隨著蠟帶連續(xù)深切，空洞越變越小，說明切片中的空洞是沒有切全而造成的人為改變。當切蠟塊用的力太大太猛時，組織中的小斑點、小斑塊會從蠟塊中脫落，在切片上留下一個個的小空洞。這種情況在脫水、透明或浸蠟處理過度的組織中極易發(fā)生。比如，肝、脾、腎、腦、淋巴結(jié)以及子宮類的標本，若取材太薄，易造成處理過度，蠟塊在粗修和切片時經(jīng)常會出現(xiàn)空洞。所以，取材時標本的厚度要適中，不能太薄。切片時如果遇到此類蠟塊，可將蠟塊在冰盤冷卻片刻或用濕的棉花沾一下，蠟塊接觸刀刃用力不能太猛太重，以減少這一人為現(xiàn)象的出現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)蠟帶上的組織切片出現(xiàn)空洞，只要蠟塊中的組織充足，應盡量再緩慢切片，直到空洞消失。另外，空洞也可能是因為組織在浸蠟時，蠟液中有殘留的空氣存在所致。這種情況在肺組織標本中尤為多見。即使連續(xù)切片空洞也不容易消失。
3、影響組織切片展片的因素有哪些?
答：1)石蠟的性質(zhì)，如蠟的硬度、蠟的熔點以及蠟的添加劑，特別是其內(nèi)某些帶有硬化性質(zhì)的添加劑。2)切片的厚薄。3)展片的水溫。對于絕大多數(shù)石蠟，漂烘儀的溫度一般定在40℃~44℃，如果溫度高于45℃，切片的皺褶會很快消失，并且石蠟會溶解。4)對于某些易于出現(xiàn)鄒折的切片，可以二次展片。具體做法是，先將組織切片放在帶有30%乙醇的玻璃平板上，然后輕輕推入漂片儀中。或者，先將組織切片放在盛有冷水的容器中，然后再用載波片裱起，輕輕移至漂片儀中。再者，將組織切片垂直立起，讓底邊先接觸漂片儀水面，然后用鑷子向右外方向輕輕推展，將組織切片光亮面平穩(wěn)輕觸水面。如此可減少切片在水面因牽拉和摜壓展片時出現(xiàn)氣泡。
4、組織切片出現(xiàn)染色白點的原因?
答：切片在脫蠟步驟完成以后，出現(xiàn)大片白色的斑點。如果這些斑點沒有被發(fā)現(xiàn)或是被及時祛除，染色后鏡下則會呈現(xiàn)出不規(guī)則的染色或染色不均勻的改變。原因是由于烤(烘)片溫度太低，玻片在脫蠟前沒有充分烤(烘)干;切片在二甲苯停留時間不足，或二甲苯使用過久，造成脫蠟不盡。處理對策：如果玻片是由于沒有烤(烘)，先用無水乙醇處理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯脫去石蠟。如果烤(烘)干不足的現(xiàn)象比較嚴重，可能導致切片脫落，則無法補救。如果白色斑點是由于切片在二甲苯停留時間不足造成，或使用的二甲苯過久，切片則需退回到二甲苯停留時間相對長些，或更換二甲苯，脫色、漂白、重新染色。
5、如何理解組織脫水過度的概念?
答：現(xiàn)在的技術(shù)人員越來越清楚地認識到，組織脫水過度并不是正真的過度。因為有人用反復實驗表明，脫水時間長的組織反而利于切片，如尸檢標本。所以說，這里的過度其實不是因組織真的脫水過度而過度，而是可能因為組織要么固定不佳，要么脫水不足，導致組織內(nèi)部含有一定水分，在遇到二甲苯透明，石蠟浸透時，在溫度的作用下引起的硬化而已。
6、組織蠟塊放冰箱冷凍好還是放冷水浸泡好?
答：組織塊的最適宜溫度不是一成不變的。把組織塊放冰箱冷凍或用冰塊冷卻組織有助于切較硬的組織，因為這樣做可以使組織和蠟塊之間保持均勻一致的硬度。如果將組織放入冷水中，則可以使硬度均勻降低，還可以適當增加組織塊的濕度。用噴霧冷卻劑來冷卻組織塊的表面，效果并不理想。如果必須要使用，那么盡量只噴灑極少量，以防止組織塊表面結(jié)冰或者整個組織塊開裂。
7、用于包裹小組織的紙如何選擇?
答：盡量選質(zhì)地優(yōu)良的擦鏡紙或茶葉袋包裝紙，少選質(zhì)地差纖維多的紙張或紗布，放置粘連到小組織上影響切片質(zhì)量。另外，紙包不要太公正，以免浸蠟后包埋時，技術(shù)人員因找不到紙角難以打開紙包。包裹小組織標本時用“包混沌”方法最好，易于開包。
8、組織切片出現(xiàn)“梯田”樣改變的原因?
答：“梯田”實際是指組織切片出現(xiàn)的波紋狀改變。此類情況，大多數(shù)是因為蠟塊沒有被夾緊或刀片在切片機上沒有被擰緊的緣故。除此之外，可能還有其他其它原因，比如切片機老化機械部分松動等。另外，波紋還可能是由于刀的傾斜度過大。波紋現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)在質(zhì)地堅硬的組織蠟塊，如子宮肌瘤等。肉眼可見的波紋狀震顫在漂片水槽就能看見。對于堅硬或堅韌的組織蠟塊，可采用蠟塊表面用5N鹽酸軟化處理的辦法，改善切片質(zhì)量。方法如下：
(1)將切片中出現(xiàn)列裂隙的組織蠟塊面朝下，置入帶有5 N 鹽酸的玻璃容器或塑料容器內(nèi)，浸泡5min～10min，取出后用干紗布擦去蠟塊表面的鹽酸。
(2)蠟塊不須冷凍，在室溫(25℃)下直接在切片機切片，切片厚度4μm。
(3)裱片時，先將切片光面朝下放入冷水中，然后，再用干凈的載玻片將其移入漂片儀的水槽內(nèi)，溫度約45℃～47℃;略展片刻，待切片充分展平后，迅速裱貼在載玻片上。
(4)常規(guī)烘/烤切片、染色、封固。振顫或微小振動大多數(shù)是緣自于組織處理時過度脫水所致。但是也可能是因為刀鈍，角度太大，或者切片速度太快。如果組織的確是由于脫水過度造成的，可用濕紗布或棉花沾些許溫水檫拭蠟塊表面，將會有助于緩解這一現(xiàn)象。比如，淋巴結(jié)組織本身就缺少水分，如果取材時切的太薄，組織一經(jīng)脫水處理，就會造成處理過度、質(zhì)地堅硬，切片時產(chǎn)生振顫或微小振動，破壞淋巴結(jié)的完整結(jié)構(gòu)，讓病理醫(yī)生難以做出正確病理診斷而耽誤病人。
9、包埋后的組織出現(xiàn)脫鈣不全時的補救方法?
答：方法如下：(1)將切片中出現(xiàn)列裂隙的組織蠟塊面朝下，置入帶有5 N 鹽酸的玻璃容器或塑料容器內(nèi)，浸泡5min～10min，取出后用干紗布擦去蠟塊表面的鹽酸。(2)蠟塊不須冷凍，在室溫(25℃)下直接在切片機切片，切片厚度4μm。(3)裱片時，先將切片光面朝下放入冷水中，然后，再用干凈的載玻片將其移入漂片儀的水槽內(nèi)，溫度約45℃～47℃;略展片刻，待切片充分展平后，迅速裱貼在載玻片上。(4)常規(guī)烘/烤切片、染色、封固。
二、操作過程中的注意事項
1、組織包埋時注意“二次加蠟”
包埋操作時具體的注意事項：先取大小合適的不銹鋼模型，注入蠟液置于熱臺上，液面剛好與模型的上緣平齊，不得低于或高于此限。取出包埋盒內(nèi)的組織，校對正確后用干凈的熱鑷子將所有組織悉數(shù)放入模型的底部，待組織與模型內(nèi)的蠟液充分融合后，按要求排列后迅速移動模型至冷臺，至底部石蠟剛開始凝固，用鑷子輕壓組織數(shù)秒，待組織埋平后，迅速蓋上包埋盒注上蠟液，約過10 s～15 s，包埋盒與模型周邊的蠟液凝固后，再次補充注入少許蠟液，即進行“二次加蠟”，以增加包埋盒的穩(wěn)固性，防止切片時因包埋盒松動引起切片震顫。注意液面高度不得高于包埋盒上緣，加蓋包埋盒時一定要保持其與模型底部平面平行，無前后左右傾斜的現(xiàn)象。用塑料包埋盒包埋組織時，應注意待包埋模型底部石蠟開始凝固后，蓋上包埋盒，待其四周凝固后，進行“二次加蠟”。這樣做的目的是使得包埋盒與組織蠟塊接觸更加穩(wěn)固，減少和防止切片時產(chǎn)生振顫或包埋盒與組織蠟塊脫落。另外，還需注意的是二次加蠟不能過滿，否則蠟塊不能與切片機夾具完全吻合，造成切片時松動震顫，影響切片質(zhì)量。
2、組織切片時注意“粗修”
首先，把切片工作程序分為兩步：預備切片和正式切片，即粗修和細切。其次，每天切片之前應先檢查切片機的角度并將其調(diào)整固定，即刀座的角度約在10°，夾具的上下二邊與刀刃平行，左右二邊與刀刃垂直。預備切片和正式切片過程中所有角度均保持一致不得隨意變動。
預備切片：應用輪轉(zhuǎn)式切片機(附二檔進樣裝置)裝上舊的一次性刀片操作，將蠟塊表面多余的石蠟及不平整的組織修去，至組織盡量暴露最大面，用毛刷刷凈，重新冷凍以備正式切片。遇有鈣化或硬化組織可用5N鹽酸對蠟塊表面進行軟化處理。
正式切片：用毛刷將切片機打掃干凈，換上新的一次性刀片準備切片。切片厚度通常規(guī)定為4μm，切片的完整性平整性要求組織完整，厚薄均勻，平整無皺，無刀痕。選取平整光滑無污染的切片置入水面，用紗布將載玻片擦拭干凈，撈取切片時使切片與載玻片沿長軸方向平行。漂片儀的溫水須每日更換，保持清潔，溫度范圍在45℃～49℃之間。在載玻片上寫上正確的號碼后迅速放入烘片箱內(nèi)，烘片箱溫度設置為80℃～90℃左右。通常烘烤15min～30min即可染色。
3、切片工具的選擇，鑷子和毛刷
鑷子建議推薦使用口腔科使用的牙科20CM長彎鑷，利于切片展片的操作，眼科彎鑷太小，操作靈活性低于前者。毛刷建議推薦使用油畫筆、水粉筆，普通毛筆松散，容易刺破組織切片，不利于操作。
4、切片粗修時手輪的操作
建議推薦手輪全轉(zhuǎn)，而不是手輪上下半轉(zhuǎn)。手輪上下半轉(zhuǎn)時蠟塊不小心容易“啃刀”
5、切片時安全性的操作
切片機一般都配備手輪鎖，可以將手輪鎖定于任何位置，防止機器閑置期間意外觸及手輪，導致人員意外傷害或夾頭撞擊刀具。更人性化的切片機往往還配備第二手輪鎖，手輪把手只能被鎖定于最高點，便于在切片過程中隨時更換樣品或刀具。
無論鋼刀架還是一次性刀片架，都應該配有牢固的護刀器，在更換樣品或機器閑置的時候技術(shù)操作人員一定要養(yǎng)成良好習慣，將護刀器覆蓋在刀刃上方，對人員和刀具都是一種保護。好的護刀器必須能安全地覆蓋刀刃的全長。
6、切片現(xiàn)場一次性刀片等銳器的存放
安全是基于良好的組織，在一個干凈整潔的實驗室，是很少有機會發(fā)生事故的。標本處理完畢后，應及時消毒工作臺面和取材器械。一次性刀片用完后，玻璃制品一旦破損等等，應廢棄在標有“銳器”字樣的容器內(nèi)。
7、撈片和提片
撈片的動作是用載玻片將組織切片托起的感覺，容易在玻片上殘留多量水份。提片的動作是將載玻片向前上方提拉，將組織切片裱起，這個方法玻片上水份殘留很少。
8、烤片和烘片
組織切片放在熱臺受熱上，謂之烤片;帶有熱源的空間受熱，謂之烘片?？酒蠼M織切片裱起后先倒置將水份瀝干，等組織微微發(fā)白后，再放置熱臺烤片，5-10 min。此法要求組織切片不能帶有水份，防治組織切片因帶有的水份受熱后擴散導致組織散片。烘片時只要將組織切片裱起后，即可豎立插入染色架后置入箱內(nèi)受熱。水份的影響不是太大。
