凱氏定氮儀是根據(jù)蛋白質(zhì)中氮的含量恒定的原理，通過測定樣品中氮的含量從而計算蛋白質(zhì)含量的儀器。因其蛋白質(zhì)含量測量計算的方法叫做凱氏定氮法，故被稱為凱氏定氮儀，又名定氮儀、蛋白質(zhì)測定儀、粗蛋白測定儀。這種方法是由凱耶達(dá)爾在1883年發(fā)明的。
原理
將有機化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。在這步中，經(jīng)常會向混合物中加入硫酸鉀來提中間產(chǎn)物的沸點。樣本的分析過程的終點很好判斷，因為這時混合物會變得無色且透明(開始時很暗)
在得到的溶液中加入少量氫氧化鈉，然后蒸餾。這步會將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨。而總氨量(由樣本的含氮量直接決定)會由反滴定法確定:冷凝管的末端會浸在硼酸溶液中。氨會和酸反應(yīng)，而過量的酸則會在甲基橙的示下用碳酸鈉。滴定所得的結(jié)果乘以定的轉(zhuǎn)換因子就可以得到結(jié)果。
適用范圍
凱氏定氮儀儀器用凱氏方法檢測谷物、食品、飼料、水、土壤、淤泥、沉淀物和化學(xué)品中的氨、蛋白質(zhì)氮含量、酚、揮發(fā)性脂肪酸、氰化物、二氧化硫、乙醇等含量。具有相當(dāng)好的性價比，僅僅滴定過程需要人操作下，非常適合實驗室及檢驗機構(gòu)常規(guī)檢測。廣泛用于食品、農(nóng)作物、種子、土壤、肥料等樣品的含氮量或蛋白質(zhì)含量分析。
使用步驟
消化
1、準(zhǔn)備6個凱氏燒瓶，標(biāo)號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。用微火加熱煮沸，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底，以保證樣品消化。消化時放出的氣體內(nèi)含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中行。消化后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。
OMNILABD5000系列凱氏定氮點
1.操作其簡單，可以通過快速編程鍵式操作。有不同的語言菜單可供選擇。
2.配有光學(xué)與聲學(xué)故障報警系統(tǒng)。消化管不在位或放置不正確、未關(guān)閉安門，儀器不啟動，酸、堿、稀釋液缺少，主機可快速檢測出并暫停實驗，自動報警提示，其方便，安可靠。
3.門接觸安開關(guān)。
4.可編程的反應(yīng)和蒸餾時間。
5.自動蒸汽發(fā)電。蒸汽發(fā)電量可調(diào)從40%到。
6. 測量范圍:0.1-200mg
7.氮回收率 99.5%
8.重復(fù)性 ±1%
9.待機操作之間蒸餾。
10.立的清洗方案。
11.自動和手添加氫氧化鈉。
12.RS232接口。
13.冷凝水消耗:5 l / min
ZDDN-II凱氏定氮儀能點
1.ZDDN-II 凱氏定氮儀，采用微電腦行過程控制，包括手動模式和自動模式，可根據(jù)您的需要自行設(shè)定和切換:
自動模式下:次成加堿、加硼酸、蒸餾，氨氣吸收整個過程，加硼酸和加堿的體積以及蒸餾和吸收過程的時間都可以自行設(shè)定。
人模式下:加硼，加堿 和蒸餾吸收三個過程可以單人操作，體積，時間自行控制，滿足業(yè)用戶需求。
2.大屏幕點陣式液晶顯示，中文菜單，觸摸式按鈕，操作簡捷方便。
3.自動式蒸餾控制、自動加水、自動水位控制、自動停水和水壓過低報警。
4.各種安保護(hù):消化管安門裝置，蒸汽發(fā)生器缺水報警。
5.可存儲操作程序。
6.儀器外殼采用制噴塑鋼板，作區(qū)域采用ABS防腐板及不銹鋼底板。
7.防化學(xué)試劑腐蝕和機械損壞表面，耐酸耐堿。
8.水位檢測、低水位報警，自動斷電。
9.標(biāo)配里不含消化爐，消化爐為選配，建議選擇C型消化爐。
蒸餾吸收
蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三分組成。
1、儀器的洗滌
儀器安裝前，各件需經(jīng)般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在只鐵架臺上。儀器使用前，微量管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細(xì)檢查各個連接處，保證不漏氣。 在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石(或毛細(xì)管等)，以防沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置個錐形瓶接收冷凝水。從定氮發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈。沖洗畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2~3次，再在冷凝管下?lián)Q放個盛有硼酸-示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口浸沒在溶液中，蒸餾1~2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1~2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。
2、無機氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收
由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作術(shù)，初學(xué)者宜用無機氮標(biāo)準(zhǔn)樣品行反復(fù)練習(xí)，再行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。 取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍(lán)-甲基紅混合示劑(呈紫紅色)3~4滴，蓋好瓶口待用。取其中只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意:在此操作之前須打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未流入時，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使半水流入蒸餾瓶，半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾3~5min，移動錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準(zhǔn)備滴定。 在次蒸餾畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復(fù)沖洗干凈后，即可行下個樣品的蒸餾。按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶起滴定。
3、未知樣品及空白的蒸餾吸收
將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。 加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾行。 由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應(yīng)室。此外，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶，成堵塞。
缺陷
從凱氏定氮原理可以知道:凱氏定氮法是將含氮有機物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮硫酸銨來行檢測，以得到含氮量的測定值乘以定系數(shù)得出蛋白質(zhì)含量。而含氮有機物不僅僅是蛋白質(zhì)，還有三聚氰胺等等。在加上食品中蛋白質(zhì)含量的現(xiàn)行家標(biāo)準(zhǔn)和際通行測定方法是經(jīng)典凱氏定氮法，這就為假者提供了可乘之機。蛋白質(zhì)中的含氮量不過30%，三聚氰胺的大的點是含氮量很(66%)，溶于水后無色無味，也就是說在杯清水中加入三聚氰胺，然后用凱氏定氮法檢測，結(jié)果顯示是含有蛋白質(zhì)的。由于"凱氏定氮法"只能測出含氮量,并不能鑒定飼料中有無違規(guī)化學(xué)物質(zhì),所以,添加三聚氰胺的奶粉理論上可以測出較的蛋白質(zhì)含量。
應(yīng)用
凱氏定氮法的普遍適用性、性和可重復(fù)性已經(jīng)得到了際的廣泛認(rèn)可。它已經(jīng)被確定為檢測食品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是，這種方法并不能給出真實的蛋白質(zhì)含量，因為所測定的氮可能不僅僅是由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化來的。這可以從2007年美寵物食品污染事件和2008年中毒奶粉事件等食品安事件中被體現(xiàn):三聚氰胺，種含氮量較的物質(zhì)，被添加到了食品中以偽較的含氮量。另外，由于不同的氨基酸序列，這種方法也需要許多不同的校正因子。而且，凱氏定氮法還需要使用濃硫酸和較長時間的加熱(般來講，大于1小時)。這也成了在粗略測量蛋白質(zhì)含量時，杜馬斯法有時更方便些。
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