質(zhì)粒(plasmid)是一種染色體外、具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。質(zhì)粒具有自主復(fù)制能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。目前，質(zhì)粒已廣泛地用作基因工程中目的基因的運(yùn)載工具─載體。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA也是一種分子生物學(xué)最基本的方法。質(zhì)粒DNA 的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA 分子較染色體DNA 為小，且具有超螺旋共價閉合環(huán)狀的特點(diǎn)，從而將質(zhì)粒DNA 與大腸桿菌染色體DNA 分離。質(zhì)粒DNA 提取方法有以下幾種：堿變性法、溴乙啶-氯化銫密度梯度法、DNA質(zhì)粒釋放法、羥基磷灰石柱層法及酸酚法。
一、堿變性法提取質(zhì)粒DNA
【基本原理】
普遍采用的堿變性法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理是，利用染色體DNA 與質(zhì)粒DNA 的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在堿變性條件下(pH12.6)，染色體DNA 的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA 氫鍵也大部分?jǐn)嗔眩p螺旋也有部分解開，但共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，當(dāng)以pH 4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA 與大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。分離質(zhì)粒DNA 的方法一般包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增;收集和裂解細(xì)菌;分離和純化質(zhì)粒DNA。
【器材】
1.1.5ml Eppendorf 管
2.微量加樣器
3.培養(yǎng)皿
4.臺式高速離心機(jī)
5.高壓滅菌鍋
【試劑】
所有的試劑均需高壓滅菌(有機(jī)溶劑除外)
1.溶液I 50mmol /L 葡萄糖
25mmol/L Tris -Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
2.溶液II 0.2mol/L NaOH
1%SDS
臨用前配制
3.溶液III 5mol/L 乙酸鉀60ml
3mol/L 冰乙酸11.5ml
ddH2O 28.5ml
pH 5.2
4.RNase A： 10mg/ml
5.TE緩沖液： 1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
6.Tris-Cl(pH8.0)飽和苯酚
7.氯仿/異戊醇(v/v)： 24/1
8.70%：乙醇
9.LB/Amp： LB/氨芐青霉素(50μg/ml)
【操作步驟】
1.從選擇性培養(yǎng)平板上取出一個菌落，移至含有2ml LB/Amp 培養(yǎng)基的試管中。在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12-16h。
2.將1.5ml培養(yǎng)物移至1.5 ml Eppendorf管中，4000 rpm離心8min。
3.棄上清，將細(xì)菌沉淀懸浮在100μl 預(yù)冷的溶液I 中，并加入2.5μl RNase A(10mg/ml)。
4.加200μl 新配制的溶液II, 蓋緊管口?？焖兕嵉闺x心管5 次使內(nèi)容物混合、放置冰上5min。
5.加150μl預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口。將管顛倒5-8 次，冰上放置20min。
6.離心(1000rpm，4℃，5min)，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
7.加等體積苯/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，離心同上。
8.將水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇混勻后置冰上20min。
9.10 000rpm 4℃離心10min。
10.棄上清，加入0.5ml 70%乙醇洗滌DNA 沉淀，離心棄上清，在空氣中使質(zhì)粒DNA干燥10min。
11.將質(zhì)粒DNA溶于20μl，ddH2O 中，4℃保存。
二、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA
【基本原理】
此試劑盒用于質(zhì)粒DNA小量純化。該試劑盒采用了傳統(tǒng)的SDS堿裂解法，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便之特點(diǎn)，全套操作只需1小時便可完成。使用本試劑盒可從1-4ml 的過夜培養(yǎng)的菌液中純化得到1～20μg的高純度質(zhì)粒DNA，此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各種酶促反應(yīng)等。
【器材】
1.離心機(jī)
2. Spin Column
3. Collection Tube (2ml)
【試劑】
1.RNase A1 (50mg/ml)*1 6μl
2.Solution I*1 3ml
3.Solution II*2 3ml
4.Solution III 4.8ml
5.Rinse A 5.5ml
6.Rinse B 16ml
7.Elution Buffer*3 0.8ml
*1 初次使用試劑盒時，請將RNase A1 全部加入到SolutionI 中，混合均勻后4℃保存。
*2若出現(xiàn)沉淀，請于37℃保溫溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。
*3 Elution Buffer組成：2.5mmol/L Tris-Cl(pH 8.5)。
【操作方法】
1.大腸桿菌的培養(yǎng)。
從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至1～4 ml 的含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。注)培養(yǎng)液不宜過量，培養(yǎng)液過量時，會因菌量太大而溶菌不充分，純化時會影響質(zhì)粒的純度。
2.取 1～4 ml的過夜培養(yǎng)菌液，12 O0O rpm離心2min，棄上清。
3.用250μl的Solution I (含RNase A1)充分懸浮細(xì)菌沉淀。注)注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器(Vortex)等劇烈振蕩使菌體充分懸浮。
4.加入250μl的Solution II 輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5～6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。注)此步驟不宜超過5min。
5.加入400μl 的4℃預(yù)冷的Solution III ，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5～6 次，直至形成緊實凝集塊，然后室溫靜置2min。
6.室溫 12 000 rpm 離心5min，取上清。注)此時4℃離心不利于沉淀沉降。
7.將試劑盒中的 Spin Column按置于Collection Tube 上。
8.將上述操作 6的上清液轉(zhuǎn)移至 Spin Column 中，360Orpm 離心 1min (如SpinColumn中有液體殘留，可適當(dāng)提高離心速度，再離心1min )，棄濾液。
9.將500μl 的Rinse A加入Spin Column中，3600rpm離心3OSec ，棄濾液。
10.將700μl的Rinse B加入SPin Column中， 360Orpm 離心3OSec，棄濾液。
11.重復(fù)操作步驟10，然后 12000 rpm再離心 1min。
12.將Spin Column 按置于新的1.5 ml 的離心管上，在Spin Column 膜的中央處加入 60 μl的水或洗脫液，室溫靜置1min。注)把水或洗脫液加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。
13.12 O00 rpm 離心1min 洗脫收集DNA。
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