液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變設備參數(shù)得到解決;而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對于色譜柱和流動相的正確選擇是得到好的色譜圖的關鍵。
A、 峰拖尾
1、篩板阻塞
a、反沖色譜柱 b、更換進口篩板 c、更換色譜柱
2、色譜柱塌陷
a、填充色譜柱
3、干擾峰
a、使用更長的色譜柱 b、改變流動相或更換色譜柱
4、流動相PH選擇錯誤
a、調整PH值。對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰
5、樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應
a、加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑 b、更改色譜柱
B、 峰前延可能的原因
在大峰前，有小峰流出
柱死體積
樣品溶劑不適當
過濾片部分堵塞
柱過載
1、柱溫低
a、升高柱溫
2、樣品溶劑選擇不恰當
a、使用流動相作為樣品溶劑
3、樣品過載
a、降低樣品含量
4、色譜柱損壞
a、見A1、A2
C、 峰分叉
1、 保護柱或分析柱污染【柱中有死體積】
a、取下保護柱再進行分析。如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在， 可能是柱子被強保留物質污染，運用適當?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。
2、樣品溶劑不溶于流動相
a、改變樣品溶劑。如果可能采取流動相作為樣品溶劑。
D、 峰變形
1、樣品過載
a、減少樣品載量
E、 早出的峰變形
1、樣品溶劑選擇不恰當
a、減少進樣體積 b、運用低極性樣品溶劑
F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
1、柱外效應
a、調整系統(tǒng)連接(使用更短、內徑更小的管路) b、使用小體積的流通池
G、 K’增加時，脫尾更嚴重
1、二級保留效應，反相模式
a、加入三乙胺(或堿性樣品) b、加入乙酸(或酸性樣品) c、加入鹽或緩沖劑(或離子化樣品)
d、更換一支柱子
2、二級保留效應，正相模式
a、加入三乙胺(或堿性樣品) b、加入乙酸(或酸性樣品) c、加入水(或多官能團化合物)
d、試用另一種方法
3、二級保留效應，離子對
a、加入三乙胺(或堿性樣品)
H、 酸性或堿性化合物的峰拖尾
1、緩沖不合適
a、使用濃度50-100mM的緩沖液 b、使用Pka等于流動相PH值的緩沖液
I、 額外的峰
1、樣品中有其他組份
2、前一次進樣的洗脫峰
a、增加運行時間或梯度斜率 b、提高流速
3、空位或鬼峰
a、檢查流動相是否純凈 b、使用流動相作為樣品溶劑 c、減少進樣體積
J、 保留時間波動
1、溫控不當
a、調好柱溫
2、流動相組分變化
a、防止變化(蒸發(fā)、反應等)
3、色譜柱沒有平衡
a、在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱
K、 保留時間不斷變化
1、流速變化
a、重新設定流速
2、泵中有氣泡
a、從泵中除去氣泡
3、流動相選擇不恰當
a、更換合適的流動相 b、選擇合適的混合流動相
L、 基線漂移
1、柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)
a、控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器
2、流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移。)
a、使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氦氣。
3、流通池被污染或有氣體
a、用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。(不要用鹽酸)
4、檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線)
a、取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。
5、流動相配比不當或流速變化
a、更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。
6、柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時
a、用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。
7、流動相污染、變質或由低品質溶劑配成
a、檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑
8、樣品中有強保留的物質(高K’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。
a、使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。
9、使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調整。
a、重新設定基線。當檢測器動力學范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相。
10、檢測器沒有設定在最大吸收波長處。
a、將波長調整至最大吸收波長處
M、 基線噪音(規(guī)則的)
1、在流動相、檢測器或泵中有空氣
a、流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。
2、漏液
a、見第三部分。檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。
3、流動相混合不完全
a、用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑
4、溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)
a、減少差異或加上熱交換器
5、在同一條線上有其他電子設備
a、斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。
6、泵振動
a、在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器
N、 基線噪音(不規(guī)則的)
1、 漏液
a、見第三部分。檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。
2、流動相污染、變質或由低質溶劑配成
a、檢查流動相的組成。
3、流動相各溶劑不相溶
a、選擇互溶的流動相
4、檢測器/記錄儀電子元件的問題
a、斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。
5、系統(tǒng)內有氣泡
a、用強極性溶液清洗系統(tǒng)
6、檢測器內有氣泡
a、清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調節(jié)器
7、流通池污染(即使是極少的污染物也會產生噪音。)
a、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
8、檢測器燈能量不足
a、更換燈
9、色譜柱填料流失或阻塞
a、更換色譜柱
10、流動相混合不均勻或混合器工作不正常
a、維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置
O、 寬峰
1、流動相組成變化
a、重新制備新的流動相
2、流動相流速太低
a、調節(jié)流速
3、漏液(特別是在柱子和檢測器之間)
a、見section 3。檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音。如果必要更換密封。
4、檢測器設定不正確
a、調整設定
5、柱外效應影響
a、柱子過載 b、檢測器對反應時間或池體積響應過大 c、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內徑太大 d、記錄儀響應時間太長
a、 小體積進樣(例如：10ul而不是100ul)以1：10或1：100的比例稀釋樣品 b、減少響應時間或使用更小的流通池 c、 使用內徑為0.007-0.01的短管路 d、減少響應時間
6、緩沖液濃度太低
a、增加濃度
7、保護柱污染或失效
a、更換保護柱
8、色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低
a、更換同樣類型的色譜柱。如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。
9、柱入口塌陷
a、打開柱入口，填補塌陷或更換柱子
10、呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質的峰
a、選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果
11、柱溫過低
a、提高柱溫。除非特殊情況，溫度不宜超過75℃
12、檢測器時間常數(shù)太大
a、使用較小的時間常數(shù)
P、 分離度降低
1、流動相污染或變質(引起保留時間變化)
a、重新配置流動相
2、保護柱或分析柱阻塞
a、去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如果分析柱阻塞，可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。
Q、 所有的峰面積都太小
1、檢測器衰減設定過高
a、減少衰減的設定
2、檢測器時間常數(shù)設定太大
a、設定較小的時間常數(shù)
3、進樣量太少
a、增大進樣量
R、 所有的峰面積都太大
1、檢測器衰減設定過低
a、采取較大的衰減
2、進樣過多
a、減少進樣量
3、記錄儀連接不正確
a、正確連接記錄儀
S、高效液相色譜HPLC保留時間漂移的故障排除
保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：即保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失(例如通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下:
1：色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當長的時間來平衡色譜柱。
流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應注意：水是很容易污染的流動相成分。
2：固定相穩(wěn)定性
固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質在pH4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩(wěn)定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。
經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。
3：色譜柱污染
保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質。如：配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加。可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質的影響。
避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。
使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。
4：流動相組成
流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。
5：疏水坍塌
當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內嵌極性基團的反相色譜柱或非端基封口的色譜柱也可避免發(fā)生坍塌。
