2011年7月7日，第二屆質(zhì)譜論壇在北京師范大學(xué)英東學(xué)術(shù)講堂成功舉辦。來自北京周邊地區(qū)各研究院所、高校、檢測(cè)機(jī)構(gòu)的共計(jì)300余位專家和科研人員參加了此次論壇。
質(zhì)譜論壇由北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心發(fā)起，并得到中國質(zhì)譜學(xué)會(huì)的大力支持，協(xié)辦單位為：分析測(cè)試百科網(wǎng)和首都科技條件平臺(tái)北京師范大學(xué)研發(fā)實(shí)驗(yàn)服務(wù)基地。質(zhì)譜論壇將長(zhǎng)期定期舉辦，每年1-2期，每期將圍繞當(dāng)前質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用的熱點(diǎn)科學(xué)問題，邀請(qǐng)杰出的科學(xué)家做學(xué)術(shù)報(bào)告，并提供相互間充分的交流和溝通。
第二屆質(zhì)譜論壇的主題是質(zhì)譜技術(shù)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。本期論壇合辦和贊助方為賽默飛世爾科技公司，分析測(cè)試百科網(wǎng)(www.antpedia.com) 將長(zhǎng)期協(xié)助組織論壇，并進(jìn)行宣傳和報(bào)道。此次報(bào)告邀請(qǐng)的專家有：中科院生物物理所楊福全研究員，清華大學(xué)生命學(xué)院鄧海騰教授，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院謝劍煒研究員，以及賽默飛世爾科技公司的劉婷工程師。
質(zhì)譜論壇會(huì)場(chǎng)
北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心主任 謝孟峽教授
首先來自北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心主任謝孟峽教授致開幕詞。謝教授首先感謝大家的到來，接下來帶大家一起回顧了首屆質(zhì)譜論壇并進(jìn)行了質(zhì)譜中心相關(guān)情況介紹。
質(zhì)譜論壇的宗旨是為質(zhì)譜技術(shù)在各學(xué)科的應(yīng)用提供一個(gè)高層次的學(xué)術(shù)交流平臺(tái)，推動(dòng)質(zhì)譜技術(shù)的學(xué)科建設(shè)發(fā)展中的支撐作用。首屆質(zhì)譜論壇于去年10月份舉辦后受到了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。首屆質(zhì)譜論壇邀請(qǐng)的報(bào)告人有中國科學(xué)院北京基因組研究所劉斯奇研究員、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所的李智立教授、北京師范大學(xué)生命學(xué)院的何大澄教授。
第二屆質(zhì)譜論壇得到了賽默飛世爾科技的大力支持。謝老師提到，北京師范大學(xué)和賽默飛世爾的合作長(zhǎng)達(dá)30多年，從上世紀(jì)80年代初，北師大購買的第一臺(tái)質(zhì)譜就來自賽默飛世爾科技前身即菲尼根公司;之后在1999年購置菲尼根氣質(zhì)聯(lián)用，2005年購置了氣相穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀，2009年購置了賽默飛世爾公司第一臺(tái)線性離子阱LC/MS等等。
北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心采用分散放置，統(tǒng)一管理的運(yùn)行模式，現(xiàn)在運(yùn)行12臺(tái)大型質(zhì)譜儀器設(shè)備，分別放置在分析測(cè)試中心、生命科學(xué)學(xué)院、化學(xué)學(xué)院、環(huán)境學(xué)院、減災(zāi)與應(yīng)急管理研究院和二炮總醫(yī)院。儀器種類包括氣質(zhì)聯(lián)用儀、氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜、氣相穩(wěn)定同位素質(zhì)譜等，可以對(duì)生物大分子、藥物、環(huán)境等方面的研究提供技術(shù)支撐。作為北京師范大學(xué)教師和研究人員開展科學(xué)研究的技術(shù)支撐體系，質(zhì)譜中心在開展質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)、方法學(xué)及在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究、促進(jìn)不同學(xué)科間的交流合作、培養(yǎng)高水平、高素質(zhì)專業(yè)人才等方面發(fā)揮著非常重要的作用。
謝孟峽教授還向大家介紹了質(zhì)譜中心管理委員會(huì)成員和學(xué)術(shù)委員會(huì)成員。學(xué)術(shù)委員會(huì)還新聘請(qǐng)了中國科學(xué)院生物物理研究所楊福全研究員、清華大學(xué)鄧海騰教授、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所謝劍煒研究員。北京師范大學(xué)科技處處長(zhǎng)高尚玉教授、生命科學(xué)學(xué)院何大澄教授和分析測(cè)試中心主任李崧主任為新聘任的學(xué)術(shù)委員會(huì)成員頒發(fā)了聘書。
向北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心新任學(xué)術(shù)委員會(huì)委員頒發(fā)聘書合影，由左向右依次為：謝孟峽教授、高尚玉教授、謝劍煒研究員、楊福全研究員、鄧海騰教授、何大澄教授
質(zhì)譜論壇學(xué)術(shù)報(bào)告
賽默飛世爾科技色譜質(zhì)譜部應(yīng)用工程師 劉婷
來自賽默飛世爾科技的應(yīng)用工程師劉婷 為大家作了題為《高分辨質(zhì)譜提高代謝物鑒定的數(shù)量和可靠性》的報(bào)告。
代謝物鑒定的重要性
劉工程師講到，DMPK貫穿新藥研發(fā)的始終，F(xiàn)DA以及SFDA里面都有藥物DMPK的相關(guān)指導(dǎo)原則，即：新藥研發(fā)中，為了評(píng)價(jià)藥物的安全性和有效性，需要闡明藥物的代謝過程，并考察可能的藥物相互作用。
2002年MIST法案和2008年的FDA指南都規(guī)定了必須要鑒定出主要的代謝產(chǎn)物、活性代謝產(chǎn)物和具有毒性的代謝產(chǎn)物。并且FDA指南規(guī)定，在人血液里，在穩(wěn)態(tài)條件下，血液中的代謝產(chǎn)物達(dá)到了母藥暴露水平的10%則必須進(jìn)行定量研究。
高分辨質(zhì)譜提高代謝物鑒定的數(shù)量和可靠性
從代謝物鑒定方法的發(fā)展來看，1989年以前主要是利用TLC和HPLC 來進(jìn)行鑒定，耗時(shí)長(zhǎng)，效率不高，鑒定幾種代謝物通常需花費(fèi)幾周甚至幾個(gè)月的時(shí)間，且缺乏定性能力;90年代后，LC/MS技術(shù)得到應(yīng)用，主要應(yīng)用離子阱質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜，可以較好地定性，將幾個(gè)代謝產(chǎn)物鑒定的時(shí)間縮短為幾周，但是仍無法滿足藥物代謝研究中高通量的要求;2008年之后，高分辨質(zhì)譜在藥物代謝研究中的應(yīng)用越來越廣泛，這類質(zhì)譜包括Q-TOF、Orbitrap等，在幾天的時(shí)間內(nèi)就能鑒定出1-3個(gè)化合物。
那么為什么要用高分辨質(zhì)譜，多少分辨率才夠用呢?藥物代謝研究針對(duì)的不是標(biāo)準(zhǔn)品而是復(fù)雜的生物基質(zhì)，存在大量的干擾，高分辨的意義就在于可以有效地排除干擾。在舉例Isazophos(m/z 314.04941)的藥物定量實(shí)驗(yàn)中，存在本底噪音(m/z 314.07141)，分辨率只有在50,000以上，才可能很好地排除干擾并準(zhǔn)確定量。另一個(gè)例子是測(cè)定紅茶中的茶多酚，分辨率達(dá)到80,000時(shí)才足以準(zhǔn)確地鑒定花青素(m/z 577.13405)并排除干擾(m/z 577.15518)，和進(jìn)行定量。
關(guān)于精確質(zhì)量數(shù)的作用，可以發(fā)表在Clinbiochem. 2010. 08.018上的文獻(xiàn)來說明，該例中，質(zhì)量偏差如控制在±5ppm以內(nèi)，則能消除假陽性，提高靈敏度。穩(wěn)定的高質(zhì)量精度可獲得優(yōu)異的定量RSD重復(fù)性，并可準(zhǔn)確定性元素組成。而要獲得提取色譜峰非常對(duì)稱的峰形，和穩(wěn)定的高質(zhì)量精度，常常需要高分辨(比如舉例中需要50,000以上的分辨率)。
代謝物研究中對(duì)高分辨質(zhì)譜的要求是：具備高分辨率和高質(zhì)量精度，從而保證復(fù)雜樣品測(cè)定的質(zhì)量精度;同時(shí)還需質(zhì)量精度穩(wěn)定性好，才能保證每個(gè)掃描點(diǎn)的質(zhì)量精度。賽默飛世爾科技公司的Orbitrap質(zhì)譜是當(dāng)今分辨最高的高通量質(zhì)量分析器，它包括臺(tái)式Orbitrap系列(Exactive)和LTQ Orbitrap系列。今年ASMS推出的Q-Exactive，分辨率達(dá)到了140,000，采集速度提高了兩倍;而新推出的LTQ Orbitrap Elite，分辨率達(dá)到了240,000，采集速度提高了4倍。
Orbitrap Elite 高場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀
Q Exactive 臺(tái)式FT軌道阱質(zhì)譜儀
高分辨質(zhì)譜在代謝產(chǎn)物鑒定的應(yīng)用思路
高分辨質(zhì)譜用于代謝產(chǎn)物鑒定，最主要的兩條應(yīng)用思路是應(yīng)用多種數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理方式。數(shù)據(jù)采集有多種模式，包括DDPT數(shù)據(jù)依賴性掃描，可自動(dòng)激發(fā)做多級(jí)掃描;母藥分子式如含有鹵族元素可用同位素激發(fā)模式做數(shù)據(jù)依賴性掃描;依賴儀器需要運(yùn)用極性切換的功能來進(jìn)行代謝物確認(rèn)。
數(shù)據(jù)分析時(shí)用到兩類數(shù)據(jù)：一類是全掃描數(shù)據(jù)，一類是多級(jí)掃描數(shù)據(jù)。針對(duì)全掃描數(shù)據(jù)分析，常用方法包括質(zhì)量虧損過濾(MDF)及多重質(zhì)量虧損過濾(MMDF)、背景扣除、同位素過濾、提取離子流圖。針對(duì)多級(jí)掃描數(shù)據(jù)分析，常用子離子過濾和中性丟失過濾(即根據(jù)一些中性丟失碎片進(jìn)行代謝物查找)。
應(yīng)用實(shí)例——雷公藤甲素代謝物鑒定
接下來劉工重點(diǎn)列舉了雷公藤甲素(Triptolide)代謝物鑒定的應(yīng)用實(shí)例。雷公藤是臨床上治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要用藥，毒性很強(qiáng)，臨床表現(xiàn)為肝腎毒性。其中雷公藤甲素是雷公藤的主要藥理成分，研究雷公藤甲素的代謝產(chǎn)物特別是反應(yīng)性代謝產(chǎn)物對(duì)解釋雷公藤的肝腎毒性有重要的意義。其研究難點(diǎn)在于：質(zhì)譜離子化效果不佳，響應(yīng)強(qiáng)度不高。
該實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用賽默飛世爾科技Acclea U-HPLC和LTQ Orbitrap與Q-Exactive質(zhì)譜進(jìn)行分析，分別進(jìn)行了雷公藤甲素體外和體內(nèi)代謝分析。
在建立LC-MSn方法中，首先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，加入了NH4AC幫助形成[M+NH4]+從而提高信號(hào)響應(yīng)，解決了靈敏度問題。LTQ Orbitrap和Q-Exactive質(zhì)譜主要采用了數(shù)據(jù)依賴性掃描，其中LTQ Orbitrap主要采用的是CID加寬帶激發(fā)碰撞模式，Q-Exactive則采用HCD高能碰撞模式，從而得到更多離子碎片信息。
Metworks軟件確認(rèn)代謝物過程實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析兩種功能。Metworks軟件的MMDF(多重質(zhì)量虧損過濾)功能用于分析體內(nèi)大鼠尿液樣品，中性丟失過濾功能進(jìn)行反應(yīng)性代謝物查找，子離子過濾功能查找代謝物，Mass Frontier軟件對(duì)雷公藤甲素碎片分析，最終發(fā)現(xiàn)了107種代謝物。
中國科學(xué)院生物物理研究所 楊福全研究員
來自中國科學(xué)院生物物理研究所的楊福全研究員的演講題為《蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用》。
楊老師首先總結(jié)了用于蛋白質(zhì)組學(xué)的定性和定量技術(shù)。在蛋白質(zhì)定性方面的主流技術(shù)包括兩條路線：基于雙向電泳和生物質(zhì)譜的技術(shù)路線;基于多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)路線(美國John Yates教授創(chuàng)建)。蛋白質(zhì)組的定量當(dāng)前更受到關(guān)注，目前也有幾種技術(shù)：(1)基于表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)的差異蛋白篩選技術(shù)，應(yīng)用于臨床生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)的蛋白分子量小于20,000。(2)基于雙向電泳(2-DE)的差異蛋白質(zhì)篩選技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)10,000分子量以上的差異蛋白，后來還發(fā)展出靈敏度重現(xiàn)性更好的熒光差異電泳(DIGE)方法。(3)目前主流的基于LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，包括相對(duì)定量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記和無標(biāo)記定量策略，以及絕對(duì)定量的基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的定量策略。標(biāo)記策略又分為體外標(biāo)記(如H218O、ICAT、cICAT、iTRAQ)，以及體內(nèi)標(biāo)記(如SILAC)。無標(biāo)記定量可以用比較色譜峰面積、收集所有需進(jìn)行比較的多肽的譜圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析來相對(duì)定量，但為獲得更好的重現(xiàn)性，對(duì)色譜分離條件和樣品都要求較高。在蛋白質(zhì)組驗(yàn)證階段，用Western Blot法定量通量太低，所以現(xiàn)在流行用三重四極桿的MRM進(jìn)行絕對(duì)定量。
蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用包括：蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，疾病相關(guān)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定，蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)復(fù)合物的鑒定、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)表達(dá)變化分析分析，蛋白質(zhì)功能研究(降解機(jī)制、構(gòu)象等)。其中蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析用于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)、肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)、腦蛋白質(zhì)組學(xué)、尿蛋白質(zhì)組學(xué)、腦脊液蛋白質(zhì)質(zhì)組學(xué)以及亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)等。
接下來?xiàng)罾蠋熈信e了自己開展過的多個(gè)生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究實(shí)例，并總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，讓每個(gè)人都受益匪淺。
基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)在血清中降解機(jī)制研究中，楊老師用LC-MS的方法和分析化學(xué)的經(jīng)驗(yàn)成功解決了生物學(xué)家碰到的問題，該工作發(fā)表在2004和2005年的《Blood》上。該工作的研究目的是：生物體內(nèi)同時(shí)存在SDF-1 α 和SDF-1 β的意義何在?SDF-1不斷在基質(zhì)細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及其它細(xì)胞中表達(dá)，在骨髓中不斷被降解，其作用的酶是什么?合作的生物學(xué)家用新鮮的人血清對(duì)重組的SDF-1 α 和SDF-1 β進(jìn)行20小時(shí)的孵育處理后，用SDS PAGE分析，發(fā)現(xiàn)了分子量變化，希望楊老師能測(cè)定和解釋這種變化。但實(shí)際上當(dāng)時(shí)生物學(xué)家關(guān)心的是丟失的那段質(zhì)量，所以在處理中加了分子量透析步驟，因此開始很難找到質(zhì)譜信號(hào)。在楊老師仔細(xì)了解后，建議用LC-MS測(cè)定處理后剩余的那段分子量(m/z 7,000~9,000)，果然得到了很好的結(jié)果。隨后對(duì)SDF-1 α 的變化進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)的分析和表征。最后的結(jié)果表明：在用新鮮血清處理后，SDF-1 α在C端丟失了K、在N端丟失了KP，而SDF-1 β只在N端丟失KP。動(dòng)力學(xué)分析表明SDF-1 α先在C端丟失K、然后在N端丟失了KP，顯然有兩種起作用的酶。最后鑒定出CD26導(dǎo)致了N端KP丟失，Carboxypeptidase N導(dǎo)致了C端斷裂。
和國內(nèi)某醫(yī)院合作，楊老師課題組對(duì)白血病相關(guān)的生物標(biāo)志物進(jìn)行分離鑒定。醫(yī)院首先對(duì)健康人和白血病患者的血清進(jìn)行了SELDI分析比較，找到潛在的標(biāo)志物(目標(biāo)蛋白質(zhì))。隨后，楊老師建立了一套綜合的方法來分離鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)。前處理包括對(duì)血清樣品脫鹽、去除高豐度蛋白、HPLC分離然后得到純化的目標(biāo)蛋白，然后綜合運(yùn)用MALDI-TOF-MS直接測(cè)定分子量、酶解后用LC-MS/MS測(cè)定肽段及蛋白質(zhì)、N端序列測(cè)定等方法，最后成功地鑒定了目標(biāo)蛋白質(zhì)。
另一項(xiàng)和醫(yī)院的合作是腫瘤死亡預(yù)警蛋白質(zhì)的分離鑒定。初步的臨床觀察顯示：對(duì)比不同腫瘤患者血清的SELDI-TOF-MS檢測(cè)譜圖，可發(fā)現(xiàn)一組與腫瘤患者病情加重和預(yù)后密切相關(guān)的異常血清蛋白特征峰，其分子量范圍為11.1-11.9kDa，暫命名為死亡預(yù)警蛋白，簡(jiǎn)稱LGT。中晚期患者血清中LGT與預(yù)后的關(guān)系：LGT持續(xù)(+)2-3個(gè)月，死亡率90%以上，LGT持續(xù)(-)為零死亡;LGT由(+)轉(zhuǎn)(-)，死亡率10%。LGT疑似(±)死亡率10%。楊老師課題組將這組LGT蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，得到了13種蛋白的鑒定結(jié)果。
其它的研究還包括：線蟲線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析;大鼠L6肌管細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組分析;胰島β細(xì)胞線粒體的蛋白質(zhì)組及其磷酸化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建;SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于L6骨骼肌細(xì)胞分化前后蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析等等。由于時(shí)間有限，沒有更多地展開介紹。但接下來，楊老師回答了現(xiàn)場(chǎng)很多聽眾的熱烈提問。
清華大學(xué) 鄧海騰教授
來自清華大學(xué)生命學(xué)院的鄧海騰教授做了題為《Application of mass spectrometry beyond Proteomics》的報(bào)告，主要內(nèi)容是關(guān)于質(zhì)譜在代謝組學(xué)方面的應(yīng)用。
回顧質(zhì)譜百年發(fā)展歷史，從英國物理學(xué)家Joseph John Thomson研制出世界上第一臺(tái)質(zhì)譜儀，到現(xiàn)在復(fù)雜的Orbitraps，近一百年來質(zhì)譜的發(fā)展非常迅速，質(zhì)譜技術(shù)的開發(fā)也越來越偏重于應(yīng)用。從質(zhì)譜在Nobel上的獲獎(jiǎng)情況來看(1906年Thomson獲Nobel物理學(xué)獎(jiǎng);1922年Aston因同位素模式獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng);1939年Lawrence因回旋共振獲Nobel物理學(xué)獎(jiǎng);1989年Wolfgang Paul因離子阱獲Nobel物理學(xué)獎(jiǎng);2002年John Fenn和田中耕一因離子源獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng))，鄧教授認(rèn)為下一個(gè)質(zhì)譜方面的Nobel獎(jiǎng)可能會(huì)是傅立葉變換在質(zhì)譜儀上的應(yīng)用。傅立葉變換是一個(gè)非常重要的工具，通過傅立葉變換可以把時(shí)域信號(hào)轉(zhuǎn)化為頻率，通過頻率和質(zhì)量的關(guān)系，我們就能得到高精確度的質(zhì)譜圖。根據(jù)文獻(xiàn)(Mann and Kelleher PANS November 25,2008 vol. 105 No. 47 18135)對(duì)比，低分辨離子阱/四極桿/三重四極桿的精確度是1-0.1Da，中等分辨的飛行時(shí)間/Q-TOF的精確度為0.1-0.01Da，而高分辨的FTICR MS/FT-Orbitrap這類傅立葉質(zhì)譜儀的精確度高達(dá)0.01-0.001Da。更高的分辨將提高蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的確信度，并能夠檢測(cè)多種變化、翻譯后修飾等。
鄧教授援引Nature上的一篇提為《2020 visions》的文章，其中提到在以后十年里比較有前途的兩個(gè)領(lǐng)域是代謝組學(xué)和微生物組學(xué)。廣義的代謝組學(xué)可分為很多小的領(lǐng)域，如糖的代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等。目前科學(xué)家們還建立了代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)庫，如Scripps代謝組學(xué)中心建立的METLIN數(shù)據(jù)庫，和Human Metabolome Database。代謝產(chǎn)物檢測(cè)的流程并不復(fù)雜(比蛋白質(zhì)組學(xué)稍微簡(jiǎn)單一些)，一般為生物化學(xué)萃取-樣品制備-LC-MS(+)或LC-MS(-)/GC-MS-鑒定-定量-解釋，難點(diǎn)集中在最后兩個(gè)步驟，要借助一些軟件。
比較《Sarcosine levels in prostate cancer and its association with cell invasion》(A Sreekumar el al. Nature 457, 910-914, 2009)，把癌癥病人分為兩組，一組是癌細(xì)胞還未擴(kuò)散的病人，一組是已經(jīng)擴(kuò)散的惡性病人，進(jìn)行代謝組學(xué)分析。鑒定出1000余種小分子，并發(fā)現(xiàn)其中有6種小分子表達(dá)濃度在癌癥病人(尤其是惡性癌癥病人)中比正常人高很多，比如肌氨酸(sarcosine)。研究者還在細(xì)胞中添加了sarcosine，發(fā)現(xiàn)會(huì)增加細(xì)胞的movement擴(kuò)散度(雖然很多人認(rèn)為這不是一個(gè)非常好的證明方法)。研究者還解釋了這個(gè)小分子發(fā)生作用的機(jī)理，并指出了一種甲基化酶，把一個(gè)甲基放在了glysine上，就變成了sarcosine;而有了酶，就有了一個(gè)藥物靶向分子。這是一個(gè)非常好的例子，通過代謝組學(xué)研究，可以發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。當(dāng)然，正如蛋白質(zhì)組學(xué)研究一樣，接下來的幾年尚無法證實(shí)發(fā)現(xiàn)的這個(gè)sarcosine小分子是非常特異的生物標(biāo)志物。目前也有種觀點(diǎn)倡導(dǎo)系統(tǒng)生物學(xué)研究，即認(rèn)為真正起作用的生物標(biāo)志物可能是包含小分子、大分子等的一組物質(zhì)，來協(xié)同起作用。
接下來，鄧教授介紹了在結(jié)核病新藥研發(fā)方面的研究，結(jié)核病(TB)是一種古老的傳染病，由結(jié)核桿菌感染引起，占世界三分之一的人口感染了結(jié)核桿菌。多種耐藥性結(jié)核病菌、HIV/TB雙重感染、治療時(shí)間長(zhǎng)、存在潛伏期，這都是目前結(jié)核病治療面臨的挑戰(zhàn)。鄧教授分別介紹了他們利用代謝組學(xué)研究，來篩選新型結(jié)核病藥物。比如發(fā)現(xiàn)了三種小分子：OPB、FAD、FMN。然后用質(zhì)譜法來做代謝組學(xué)研究，并解釋了其作用的機(jī)理。鄧教授還介紹了一種方法來鑒定所有的藥物相關(guān)的代謝物。在該藥物的代謝組學(xué)研究中，用質(zhì)譜做代謝譜(profiling)得到5,000~6,000種小分子，即使送到所有數(shù)據(jù)庫大部分也得不到結(jié)果，但毫無疑問，這其中一定有些分子是和藥物有關(guān)的，鄧教授介紹了一種最常用的方法，即改變藥物分子(比如用D取代藥物分子中的H)，如果產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中有藥物分子，比較用原來的藥物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物分子和D代藥物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，會(huì)發(fā)現(xiàn)有些化合物有分子量的區(qū)別，通過這種代謝譜分析(Metabolic Profiling)，就可鑒定出所有與藥物有關(guān)的代謝物，并且推斷藥物的作用機(jī)理。
只是鑒定所有的代謝產(chǎn)物是不夠的，如果要建立一個(gè)所有代謝的代謝途徑，就要進(jìn)行Flux分析(代謝通量分析)。Flux分析在人身上是做不了的，一般都是在E. Coli(或yeast)上做的。用穩(wěn)定同位素標(biāo)記E. Coli，然后進(jìn)行代謝，在不同的時(shí)間提取代謝產(chǎn)物進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析，看看代謝產(chǎn)物的變化。比較有影響的一篇文章是《Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy》(Nature Biotechnology 26, 1179, 2008) ，它對(duì)人巨細(xì)胞病毒human cytomegalovirus (HCMV)進(jìn)行了Flux代謝通量分析。用13C標(biāo)記的葡萄糖和谷氨酰胺來喂養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)。感染HCMV的代謝通量通過包括糖解的多數(shù)中央碳代謝途徑顯著上調(diào)，特別是通過三羧酸循環(huán)和其流出到脂肪酸生物合成途徑中顯著地增加。而抑制脂肪酸生物合成的藥理抑制劑抑制了HCMV和A型流感的復(fù)制。通過該實(shí)驗(yàn)，不僅了解了代謝產(chǎn)物的變化，而且可鑒定一些新的藥物靶分子。
除了代謝組學(xué)外，還需要考慮如何從組學(xué)到基因功能。這里介紹了一些合成的小分子來作為探針(Activity-based Chemical Probes)，可以和酶的活性位點(diǎn)反應(yīng)。利用這些探針，可以檢測(cè)到酶到底在什么位置。接下來，介紹了Cravatt去年發(fā)表在Cell上的文章《Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis》(Cell. 140, 49-61. 2010)。
談到生物醫(yī)學(xué)中質(zhì)譜將來的作用，鄧教授談了幾點(diǎn)。由于質(zhì)譜具有高特異性，目前更有很多高分辨率的質(zhì)譜，所以對(duì)“其它技術(shù)可能取代質(zhì)譜”的擔(dān)憂是不必要的。而且相對(duì)于結(jié)構(gòu)生物學(xué)和單分子分析，質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)還在于可以分析混合物。談到未來的質(zhì)譜發(fā)展，鄧教授認(rèn)為，十年前我們認(rèn)為我們可以做蛋白質(zhì)組，現(xiàn)在的結(jié)論是我們只能做一部分蛋白質(zhì)組，所以和基因組/基因測(cè)序的差距還很大。未來十年二十年，希望能出現(xiàn)一種全新的質(zhì)譜，可以像基因測(cè)序儀那樣應(yīng)用。
軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 謝劍煒研究員
來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的謝劍煒研究員做了題為《芥子氣暴露的確證》的報(bào)告。首先謝研究員介紹了芥子氣暴露的確證研究的背景。
芥子氣(HD)是一種糜爛性化學(xué)毒劑，曾多次應(yīng)用于戰(zhàn)爭(zhēng)中，造成大量人員傷亡，二戰(zhàn)期間侵華日軍就曾經(jīng)在中國各地遺棄可大量化學(xué)武器，對(duì)周邊地區(qū)人民構(gòu)成了巨大威脅。芥子氣具有復(fù)雜的生物學(xué)作用機(jī)制，可與人體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、酶作用，使得細(xì)胞的代謝和功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致變性、炎癥和壞死。因此芥子氣暴露確證技術(shù)的研究非常重要。
芥子氣是一種雙功能烴化劑，在生理?xiàng)l件下極容易發(fā)生親電反應(yīng)。目前，對(duì)于芥子氣暴露確證技術(shù)的研究的難點(diǎn)主要集中在以下幾點(diǎn)：
(1)毒理機(jī)制尚不十分明確;(2)暴露后有潛伏期，不能及時(shí)診斷;(3)癥狀與燒傷、化學(xué)傷類似;(4)靶器官廣泛，無特效解毒藥。
生物標(biāo)志物是生物體內(nèi)污染物暴露劑量和生物效應(yīng)的指示劑。在毒物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、暴露確證、疾病預(yù)警、防治效果評(píng)價(jià)等方面起著重要作用。生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究是芥子氣中毒或暴露確證的基礎(chǔ)，對(duì)芥子氣中毒的臨床快速診斷，中毒程度的評(píng)估以及針對(duì)性的醫(yī)療救治具有重要意義。
芥子氣在生物體內(nèi)的主要代謝途徑包括水解氧化、與蛋白質(zhì)加合、與DNA加合、以及與谷胱甘肽加合后經(jīng)β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。芥子氣的生物標(biāo)志物類型包括：原型、代謝物、DNA/蛋白加合物。生物標(biāo)志物如果是原型，則迅速反應(yīng);如果是代謝物，存在時(shí)間也較短(數(shù)日);如果是DNA/蛋白質(zhì)加合物，可以存在幾周到幾個(gè)月的時(shí)間，這就更有利于核查員到當(dāng)?shù)氐臋z測(cè)(比如如何指正幾個(gè)月前曾制造過芥子氣的地點(diǎn))。
接下來，謝研究員詳細(xì)介紹了他們實(shí)驗(yàn)室在這方面所做的研究。研究思路為：合成純化相關(guān)生物標(biāo)志物參考品(含同位素標(biāo)記參考品)，然后建立溯源性技術(shù)方法(色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，方法遵循FDA生物分析方法認(rèn)證的要求)，再研究染毒動(dòng)物模型的時(shí)量效關(guān)系，并從體外實(shí)驗(yàn)，到體內(nèi)，再到診斷治療。目前，其課題組已經(jīng)分別建立了芥子氣暴露后的DNA-加合物、蛋白質(zhì)加合物、水解和代謝產(chǎn)物的高靈敏度、高選擇性質(zhì)譜分析技術(shù)方法：
(1)DNA加合物是由具有親電集團(tuán)的化合物或其體內(nèi)代謝產(chǎn)物與DNA共價(jià)鍵合所形成的化合物，是DNA化學(xué)損傷最重要和最普遍的形式。謝研究員課題組通過大鼠的體內(nèi)外染毒實(shí)驗(yàn)-提取DNA-水解DNA-超高壓液相色譜-三重四極桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四種DNA加合物在生物體內(nèi)的分布及代謝過程，從分子水平研究HD-DNA加合物與暴露劑量、損傷效應(yīng)之間的聯(lián)系，為HD毒理機(jī)制的深入研究提供了技術(shù)基礎(chǔ);其中1-21天取血樣和組織樣可檢測(cè)DNA加合物N7-HETEG，并可作為生物標(biāo)志物。
(2)采用LC-MS/MS方法，進(jìn)行HD-蛋白質(zhì)加合物位點(diǎn)的篩選與評(píng)價(jià)。芥子氣與血液中豐度較高的蛋白(珠蛋白和HSA)均可發(fā)生多位點(diǎn)共價(jià)反應(yīng)。包括球蛋 白的17條肽段，HSA的24條肽段以及球蛋白的N-端V殘基、HSA的Q殘基，另外還有16中氨基酸殘基。謝研究員分別介紹了芥子氣與Glu殘基、Cys殘基、HSA肽段、珠蛋白間的加合反應(yīng)及其加合位點(diǎn)。然后設(shè)計(jì)了技術(shù)路線：HD和/或HD-d4染毒全血-取紅細(xì)胞后提取蛋白-加入珠蛋白后進(jìn)行Edman降解-SPE萃取后衍生化-通過同位素稀釋-GC-MS(NCI)方法檢測(cè)體外染毒(芥子氣暴露)人全血樣中的HETE-Val狀況，并與家兔體外染毒情況進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果表明N-HETE-Val可作為芥子氣中毒潛伏期(染毒后15分鐘)以及中毒癥狀消失后(103天)的診斷生物標(biāo)志物和溯源性檢測(cè)生物標(biāo)志物。
(3)用同位素稀釋-GC-MS檢測(cè)尿樣中的TDG和TDGO，并與家兔染毒情況進(jìn)行了比對(duì)。
(4)通過家兔皮膚染毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芥子氣中毒體內(nèi)谷胱甘肽加合物β-裂解產(chǎn)物的溯源性核查時(shí)間長(zhǎng)達(dá)28天。對(duì)于各染毒劑量組，β-裂解產(chǎn)物的排出量均在前 2天的尿樣中較高，3天后排出量就比較少。一周內(nèi)排出總量的99%以上。結(jié)果表明β-裂解產(chǎn)物還原產(chǎn)物SBMTE因其在染毒后一段時(shí)間內(nèi)存在高濃度水平，且體內(nèi)無內(nèi)源性物質(zhì)存在，是確證芥子氣暴露生物標(biāo)志物之一;1-4天取血漿樣，1-28天取尿樣。
實(shí)驗(yàn)室參觀
論壇結(jié)束后，大家一同乘車前往清華大學(xué)，參觀了生物醫(yī)學(xué)測(cè)試中心蛋白化學(xué)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室。以下是圖文報(bào)道：
踴躍參觀，儀器負(fù)責(zé)人給大家介紹Orbitrap Velos
nLC-LTQ Orbitrap Velos，現(xiàn)場(chǎng)人太多，只能拍到側(cè)面
