在2010年10月15日召開的首屆質(zhì)譜論壇(首屆質(zhì)譜論壇召開 質(zhì)譜中心三年慶典)上，共有四位教授、專家做了學(xué)術(shù)報(bào)告，100余位關(guān)心質(zhì)譜技術(shù)的專家、學(xué)生和幾位報(bào)告人一起，分享了精彩的報(bào)告。
布魯克道爾頓公司的應(yīng)用經(jīng)理張欣怡博士首先做了題為“蛋白質(zhì)組學(xué)與生物質(zhì)譜”的報(bào)告。在報(bào)告中，張博士首先回顧了該學(xué)科和技術(shù)在過去幾十年里的發(fā)展，指出在以下三方面獲得飛速發(fā)展，使質(zhì)譜成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究不可缺少的工具。這三方面包括：MALDI/ESI發(fā)明后的質(zhì)譜技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在存貯容量和速度方面的進(jìn)步、以及基因組測序方面的革新。她指出：隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入發(fā)展，對質(zhì)譜提出愈來愈高的要求;而蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，又促進(jìn)了生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷提高。目前認(rèn)為，蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要兩條路線，一條路線基于MALDI路線，一條基于ESI液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。布魯克道爾頓公司為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了完整多樣化的解決方案和業(yè)界領(lǐng)先的新技術(shù)與專利，比如：ultrafleXreme MALDI TOF/TOF，micrOTOF-Q II，maXis Q-TOF，離子阱等技術(shù)。
布魯克道爾頓公司的應(yīng)用經(jīng)理張欣怡博士：蛋白質(zhì)組學(xué)與生物質(zhì)譜
接下來張博士先主要介紹了其MALDI技術(shù)路線包括：2D膠-MALDI TOF/TOF;LC-MALDI TOF/TOF;液體芯片-MALDI TOF：醫(yī)學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)ClinProt;MALDI分子成像;微生物的鑒別與分類：MALDI Biotyper;MALDI-TDS(Top-Down Sequencing)自上而下的蛋白末端序列分析等。
張博士舉了一個(gè)例子，用MALDI分子成像技術(shù)來發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測組織中的生物標(biāo)志物，該實(shí)例主要來區(qū)分乳腺癌組織為HER2陽性還是HER2陰性癌變。該方法的流程為：1)導(dǎo)電玻璃片固定組織冷凍切片;2)組織切片表面噴以基質(zhì);3)MALDI TOF質(zhì)譜儀測定;4)運(yùn)用flexImaging分子成像軟件來監(jiān)測和ClinProtTools軟件來鑒定樣本間的差異。布魯克道爾頓公司提供性能可靠、獨(dú)一無二的硬件組合，包括：Imageprep基質(zhì)噴霧儀、導(dǎo)電載玻片、樣品靶體、Smartbeam激光、以及高性能MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀。該方法和結(jié)果發(fā)表在J. Proteome Research期刊上(2010,9, 1854-1863)。
張博士介紹的另一個(gè)例子是用MALDI Biotyper來進(jìn)行微生物的快速鑒別與分類。布魯克道爾頓公司建立了強(qiáng)大豐富的微生物數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用簡單、快速、高通量、高準(zhǔn)確度的方法(MALDI Biotyper技術(shù))來獲得微生物蛋白質(zhì)特征指紋譜，從而鑒定微生物。在全球利用該技術(shù)來鑒定微生物的實(shí)驗(yàn)室有200家，中國疾病控制中心也購置了該系統(tǒng)。布魯克道爾頓公司在該技術(shù)上占有全球絕對領(lǐng)先的地位。
在ESI技術(shù)上，布魯克道爾頓公司擁有高分辨、高質(zhì)量精度的質(zhì)譜技術(shù)和強(qiáng)大的軟件工具Biotools，可以開展許多尖端的研究如：DeNovo Sequence未知多肽從頭測序;翻譯后修飾鑒定;定量蛋白質(zhì)組學(xué)。在翻譯后修飾鑒定方面，舉例了在鯊魚腦組織研究中，鑒定的多肽鏈硫酸化、磷酸化修飾、N-端乙?；揎椀?，并可利用高分辨來區(qū)分蛋白質(zhì)甲基化的假陽性。在定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面，布魯克道爾頓公司可提供非標(biāo)記(ProteomeQuant Workflow)、標(biāo)記(利用DIGE、SILAC、ICPL等技術(shù))兩種工作流程。
在ESI技術(shù)上，布魯克道爾頓公司還提供amaZon離子阱技術(shù)，配合使用ETD(電子轉(zhuǎn)移解離)技術(shù)，在翻譯后修飾、深入蛋白質(zhì)研究方面具有更多獨(dú)特的優(yōu)勢。
中國科學(xué)院北京基因組研究所劉斯奇研究員做了題為“Protein biomarkers in clinical assay using mass spectrometry: possibility and difficulties”(使用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)臨床醫(yī)學(xué)中蛋白生物標(biāo)志物：可能性和難點(diǎn))的報(bào)告。劉研究員首先以非常吸引人的開頭介紹了兩屆Nobel獎(jiǎng)獲得者Frederick S. Sanger教授曾經(jīng)寫下的話。Sanger教授一生只寫過三篇文章，拿了兩個(gè)Nobel獎(jiǎng)，第一個(gè)獎(jiǎng)是Insulin的測序，第二個(gè)是DNA的測序。Sanger教授在1958年曾表達(dá)了希望有一天可以做到蛋白質(zhì)完全測定和測序，所以，劉教授開篇引用Sanger教授的話，即指出了蛋白質(zhì)研究的重要性。蛋白質(zhì)帶有的信息豐富，在不同時(shí)間、空間點(diǎn)上表達(dá)的狀態(tài)是不同的，有不同的修飾和相互作用，蛋白質(zhì)組分析是現(xiàn)今所有其它核酸分析等技術(shù)所無法取代的。蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的測定有很多特點(diǎn)，比如可直接從生物體液中取樣，和疾病的狀態(tài)聯(lián)系更緊密。對于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物來說，是1984年Nobel獎(jiǎng)獲得者的發(fā)現(xiàn)，三位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了單克隆抗體，創(chuàng)造了以抗體為基礎(chǔ)進(jìn)行生物標(biāo)志物鑒定的一個(gè)時(shí)代，現(xiàn)在已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)院臨床。
中國科學(xué)院北京基因組研究所劉斯奇研究員：Protein biomarkers in clinical assay using mass spectrometry: possibility and difficulties(使用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)臨床醫(yī)學(xué)中蛋白生物標(biāo)志物：可能性和難點(diǎn))
這種以抗體為基礎(chǔ)的方法(如ELISA)有很多優(yōu)點(diǎn)，比如：特異性強(qiáng)、高通量、容易使用和測定等。但這種方法也存在一些問題，比如：它認(rèn)為一個(gè)疾病和一個(gè)抗體相關(guān)，而其實(shí)疾病常常是多個(gè)蛋白共同作用的結(jié)果。另外不同產(chǎn)地、不同個(gè)體間、不同特性的差異，如果要做多個(gè)蛋白、多個(gè)抗體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，就使不同實(shí)驗(yàn)室測定的結(jié)果很難保持一致。同時(shí)抗體這種方法的開發(fā)應(yīng)用到臨床又是非常漫長和高花費(fèi)的，比如發(fā)展一個(gè)臨床方法需要花費(fèi)10萬美元以上。從FDA批準(zhǔn)的基于抗體的方法，從1977 ~ 1993年批準(zhǔn)了87個(gè)，平均每年批準(zhǔn)5.8個(gè);而在1994 ~ 2009年近15年來只批準(zhǔn)了22個(gè)，平均每年批準(zhǔn)僅1.5個(gè)，最近幾年基本沒有。這說明一個(gè)新技術(shù)剛出現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)很多;而過了一段時(shí)間，發(fā)現(xiàn)會變得緩慢，也會進(jìn)一步呼喚新技術(shù)的出現(xiàn)。這時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，而蛋白質(zhì)組學(xué)自誕生之日起，世界各國的期待都是發(fā)現(xiàn)跟疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，包括中國第一個(gè)支持的項(xiàng)目就是疾病蛋白質(zhì)組?？墒陙恚€沒有一例用蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物用于臨床上，這時(shí)會有一些人來質(zhì)疑。劉教授下面即開始解釋這些科學(xué)的難點(diǎn)，并為我們描述未來的方向。
從ESI和MALDI的發(fā)明開始，質(zhì)譜技術(shù)開始越來越廣泛地應(yīng)用到生物領(lǐng)域。幾個(gè)月前一位著名的專欄作家Peter Mitchell. 在Nature Biotech(2010, 28:665-670)上發(fā)表題為“Proteomics retrenches”的綜述文章，提出今后幾年蛋白質(zhì)組發(fā)展必須要走的幾種方向。主要就是要使蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)成為可重現(xiàn)的，走向定量蛋白質(zhì)組學(xué)。所以，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)變得非常迫切，并要回答技術(shù)上是否可行的問題。不久前悉尼舉辦了HUPO會議，主要的主題就是：是否能在大規(guī)模蛋白質(zhì)組的研究中，能夠提供定量的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。另外，Matthias Mann不久前在PNAS(2008, 105:18132-18138)上提出了精度蛋白質(zhì)組(Precision proteomics)的概念，強(qiáng)調(diào)了高分辨和高質(zhì)量準(zhǔn)確度的技術(shù)。
至今，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展有兩大方向：從定性到定量，從發(fā)現(xiàn)到目標(biāo)物分析(From discovery to target)。這里不得提到美國NCI(國家癌癥研究中心)從2006年開展的一個(gè)項(xiàng)目，這個(gè)項(xiàng)目由NCRI設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分配給美國8家頂尖實(shí)驗(yàn)室來進(jìn)行，主要是通過比對實(shí)驗(yàn)來考察和確立目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法是否可行。該實(shí)驗(yàn)選擇了9個(gè)跟疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，并合成了標(biāo)準(zhǔn)的多肽，分為三個(gè)流程分配給8家實(shí)驗(yàn)室，讓實(shí)驗(yàn)室任意選用儀器和方法來測定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)過程，從簡單到復(fù)雜。最近NCI把結(jié)果發(fā)表在Nature Biotech(2009; 27:633-41)上，比較了Interlab和Intralab之間的數(shù)據(jù)比對結(jié)果。發(fā)現(xiàn)表明，目前有些實(shí)驗(yàn)可以滿足偏差< 15%，而在應(yīng)用于血漿樣品時(shí)會有< 25%的較大偏差，這跟不同實(shí)驗(yàn)室如何對血漿進(jìn)行前處理非常相關(guān)，NCI就此也提出了一系列的前處理策略。在定量策略上，NCI也提出要在全球建立基于MRM的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法和數(shù)據(jù)庫。另外，從世界著名的蛋白質(zhì)組學(xué)權(quán)威學(xué)術(shù)專家Ruedi Aebersold教授的實(shí)踐來看，他表示當(dāng)前各個(gè)廠家獲得的MRM結(jié)果是類似的，所以在全球范圍建立基于MRM定量的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫方法是可行的。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所的李智立教授做了題為“傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR MS)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用”的報(bào)告。李教授首先指出，當(dāng)前在用質(zhì)譜來研究蛋白質(zhì)組學(xué)、鑒定蛋白質(zhì)方面，我們很多時(shí)候還處于“瞎子摸象”的階段，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候不知道到底測定的是細(xì)胞、組織中的哪個(gè)蛋白，即唯一性不夠。這是為什么呢?李教授列舉了分子量在399左右的一系列分子及其分子式，它們的分子量差別僅在ppb級別;除了分子量的微小差別，這幾個(gè)化合物的同位素分布也有極其微小的差別。這要求我們進(jìn)一步去了解質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)和原理。在簡要地介紹了質(zhì)譜原理后，李教授介紹了其實(shí)驗(yàn)室的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR MS)，并列舉了近一年來他在其上做出的工作。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所的李智立教授：傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR MS)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
在應(yīng)用上，F(xiàn)TICR MS可應(yīng)用于生物大分子，做蛋白質(zhì)鑒定、蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)鑒定、復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的分離分析、蛋白質(zhì)突變點(diǎn)分析、蛋白質(zhì)精確分子量測定等挑戰(zhàn)性極高的工作。李教授介紹了一系列發(fā)表在PNAS、AC、JASMS、COB等期刊上的實(shí)例，來介紹FTICR MS在生物大分子方面的工作，F(xiàn)T ICRMS可以獲得更精細(xì)的、更確定的結(jié)果。比如：磷酸化位點(diǎn)的鑒定和確認(rèn)(PNAS 2006：103：3094-3099)，二硫鍵的定位及確認(rèn)(AC. 2009 p. 7611)，蛋白質(zhì)混合物的鑒定(JASMS. 2009)，蛋白質(zhì)混合物分子量的精確測定，代謝物分析(COB, 2010. p35)，血清中小分子的代謝物分析(Metabolomics. 2008. p126)，鼠腦組織的組織成像(JASMS 2007. 145)等。李教授還介紹了組織成像實(shí)驗(yàn)需要注意的事項(xiàng)，比如要考慮樣本處理方法的影響，樣本自身變化的影響，儀器的選擇和儀器性能的影響等。
北京師范大學(xué)生命學(xué)院的何大澄教授做了題為“讓質(zhì)譜結(jié)合跟上蛋白組學(xué)研究的動態(tài)——SiLAD技術(shù)及其在細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用”的報(bào)告。何教授首先向大家介紹了前幾天的香山會議，科學(xué)家們一起討論了蛋白質(zhì)組學(xué)的挑戰(zhàn)和機(jī)遇?，F(xiàn)代的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)稱為“基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)”，可見質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用是多么重要。
北京師范大學(xué)生命學(xué)院的何大澄教授：讓質(zhì)譜結(jié)合跟上蛋白組學(xué)研究的動態(tài)——SiLAD技術(shù)及其在細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用
接下來，何教授從蛋白質(zhì)組學(xué)的基本使命談起，指出動態(tài)和體內(nèi)是蛋白質(zhì)組的靈魂。目前的方法都是比較蛋白質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn)的存在量，難以檢測出微細(xì)的變化和進(jìn)出的狀態(tài)，靈敏度和通量的不足都在實(shí)際上制約了時(shí)間分辨率和造成對一些動態(tài)變化的掩蓋。因此，何教授課題組提出了創(chuàng)新的SiLAD動態(tài)蛋白質(zhì)組技術(shù)，SiLAD是一種35S體內(nèi)標(biāo)記的動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)首先用35S體內(nèi)脈沖標(biāo)記樣本，脈沖標(biāo)記15min(最短8min)，35S 完全不影響細(xì)胞正常的代謝/合成，只有在很短的時(shí)間(幾分鐘)內(nèi)合成的蛋白被標(biāo)記;接著把帶有標(biāo)志的蛋白取出來用雙向電泳分離、進(jìn)行CBB(Coomassie blue ，考馬斯亮藍(lán))染色并用Phospho-image高速獲得圖像;觀察差異蛋白2DE譜;將觀察到的發(fā)生明顯功能性變化的蛋白轉(zhuǎn)移出來進(jìn) 行MS/MS鑒定。這樣就得到了真正的差異表達(dá)蛋白，差異在表達(dá)活性上。SiLAD技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：可先排除已存在蛋白質(zhì)的干擾，大大提高表達(dá)差異篩選的敏感性;可顯示15min內(nèi)所研究蛋白表達(dá)的平均速度，顯著提高試劑分辨率并更直接地反映相關(guān)細(xì)胞活性;具有高通量能力，可同時(shí)檢測大量差異表達(dá)蛋白;不影響蛋白質(zhì)的鑒定。
何教授通過血清饑餓培養(yǎng)細(xì)胞(serum starved cultured cell)和鼠肝切除術(shù)(Rat Liver Hepatectomy)兩個(gè)模型說明SiLAD在G0(即增殖暫時(shí)休止期)/G1轉(zhuǎn)變中的應(yīng)用。SiLAD技術(shù)反映了蛋白質(zhì)生成的速度和時(shí)間的關(guān)系曲線，更直接地反映了細(xì)胞生命周期活動的不同動態(tài)類型。
該研究成果闡明了一定條件下，G0期細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的整個(gè)過程。比如在大鼠體內(nèi)肝臟切除的研究中，肝臟細(xì)胞一般處在G0期，部分肝切除后，細(xì)胞重新進(jìn)入增殖周期。深入了解這一過程的機(jī)理，對腫瘤防治(腫瘤可以視為細(xì)胞周期病，如使之停留在G0期，腫瘤就無害了)以及干細(xì)胞的研究和應(yīng)用(主要任務(wù)就是如何讓干細(xì)胞擴(kuò)增，然后再誘導(dǎo)定向分化)均有重要意義。
最后，何教授總結(jié)：許多現(xiàn)行傳統(tǒng)技術(shù)獲得的差異蛋白分析結(jié)果在采用SiLAD技術(shù)后會被改寫!比如，更關(guān)注的將不再是某種蛋白總量變化的多少，而是某種蛋白發(fā)生變化的動力學(xué)，是變化的速率。
報(bào)告會后，進(jìn)行了興奮的互動抽獎(jiǎng)活動，北京師范大學(xué)生命學(xué)院的何大澄教授、布魯克道爾頓公司大中華區(qū)總經(jīng)理王洪琦先生、布魯克道爾頓公司的維修部經(jīng)理馬龍華先生、北京師范大學(xué)分析測試中心李崧主任分別上臺，抽出了當(dāng)日的幸運(yùn)獎(jiǎng)品。他們分別獲得了雙肩背包和精美茶具。
抽獎(jiǎng)活動
會后，大家參觀了北京師范大學(xué)質(zhì)譜中心與布魯克道爾頓公司的合作實(shí)驗(yàn)室，并向兩家的技術(shù)人員咨詢了很多應(yīng)用問題。據(jù)了解，micrOTOF-QII液質(zhì)聯(lián)用儀和320-MS串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀安裝不久就馬上投入了使用，現(xiàn)在已經(jīng)開始為校內(nèi)外提供服務(wù)和研發(fā)合作。
與會專家參觀320-MS串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀
與會專家參觀micrO-TOF QII高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀
合影
