（一）比色法
分光光度法的前身是比色法。比色分析法有著很長的歷史。1830年左右，四氨絡銅離子的深藍色就被用于銅的測定。奈斯勒的氨測定法起源于1852年，大約在同一年，硫氰酸鹽被用來分析鐵。1869年，舍恩報道說鈦鹽與過氧化氫反應會產(chǎn)生黃色，1882年，韋勒（Weller）將此黃色反應改進成一種鈦的比色法。釩也能與過氧化物發(fā)生類似的反應，生成一種橙色絡合物。1912年，梅勒一方面利用1908年芬頓發(fā)現(xiàn)的一個反應（二羥基馬來酸與鈦反應呈橙黃色，與釩反應無此色），另一方面利用與過氧化物的反應，得出了一種鈦和釩這兩種元素的比色測定法。
吸收光度分析法提供了非化學計量法的一個很好例子。有色化合物的光吸收強弱隨著所用輻射波長的大小而變化。因此早期的比色法主要憑經(jīng)驗將未知物與濃度近似相等的標準溶液進行對比。比如象奈斯勒在氨測定法中所作的比較。比色劑，如杜波斯克比色計，是通過改變透光溶液的厚度和利用比爾定律，來對未知物的顏色與標準液的濃度進行對比的，這種儀器并不適用于所有的有色物質(zhì)，它充其量也不過經(jīng)驗程度很高罷了。 1729年，P·布古厄（Bouguer）觀察到入射光被介質(zhì)吸收的多少與介質(zhì)的厚度成正比。這后來又被J·H·蘭貝特（Lambert，1728—1777）所發(fā)現(xiàn)，他對單色光吸收所作的論述得到了下列關系式：
上式中I是通過厚度為x的介質(zhì)的光密度，a是吸收系數(shù)。利用邊界條件x=0時，I=I0，積分得到：
I=I0e-ax
1852年，A·比爾（Beer）證實，許多溶液的吸收系數(shù)a是與溶質(zhì)的濃度C成正比的。盡管比爾本人沒有建立那個指數(shù)吸收定律公式，但下列關系式
I=I0e-acx
仍被叫做比爾定律，式中濃度和厚度是作為對稱變數(shù)出現(xiàn)的。這個名稱似乎是在1889年就開始使用了。
1940年以前，比色法一直是最直觀的分析法，往往是以高度經(jīng)驗為根據(jù)的——實際上依靠了奈斯勒管、杜波斯克比色計和拉維邦色調(diào)計。色調(diào)計利用可疊加有色玻璃盤作為顏色比較的載片。某些測定甚至是將顏色與彩紙和有色玻璃作比較來進行的。T·W·理查茲在有關鹵化銀的測定方面，發(fā)明了一種散射濁度計，用通過微濁溶液來測量光散射。
1940年初左右，分光光度計開始廣泛使用，幾種高質(zhì)量、應用簡便的工業(yè)儀器使比色法更加普及，最著名的儀器，如蔡斯—普爾費利希、希爾格、斯佩克爾、貝克曼和科爾曼分光光度計，采用濾波器、棱鏡和光柵，使光的波長限制在一個很窄的范圍內(nèi)。光吸收一般是用光電管測量的。
典型的比色試劑是二苯基硫卡巴腙（diphenyl-thiocarbazone）通常叫做雙硫腙dithizone，是艾米爾·費歇爾在1882年發(fā)現(xiàn)的，他觀察到雙硫腙很容易和金屬離子形成有色化合物，但他沒有繼續(xù)這項研究。1926年，海爾穆特·費歇爾研究了這個化合物，并報道了把它用于分析的可能性，這種可能性在30年代得到了最充分的利用。這種試劑與大量陽離子所形成的有色螯合物極易溶解于氯仿那樣的有機溶劑中。于是，這種絡合物就可從大量的水溶液中萃取到少量的溶劑中，從而使這種方法對痕量物質(zhì)也非常靈敏。
比色法借助儀器可用于波長短到2000Å的紫外區(qū)。向紫外區(qū)的進一步擴展是不可能的。因為容器、棱鏡及空氣本身也會吸收光。記錄方法（起初主要是照相記錄），隨著實用光電管的發(fā)展得到了明顯的改進。紫外分光光度法在測定芳香化合物，如苯酚、蒽和苯乙烯方面特別有價值。
紫外吸收在研究有機化合物的結構時也很有用，它同束縛松散的電子締合，如出現(xiàn)在雙鍵中的電子。乙烯、乙炔、羰基化合物和氰化物中的不飽和鍵吸收2000Å以下的光，因此處于紫外分光光度計可測范圍之外。不飽和鍵周圍有取代基時，會使光的吸收向長波方向移動，但仍遠離實際可測的范圍。偶氮基、硝基、亞硝酸鹽、硝酸鹽和亞硝基的吸收光范圍在2500～3000Å之間。不飽和鍵發(fā)生共軛現(xiàn)象會使吸收增強。引起光向長波方向移動。芳香環(huán)具有一個特征吸收本領，可用于鑒定。
（二）紅外光譜法
輻射能吸收用作一種分析工具的最大進展也許是在紅外光譜領域。1920年以前，利用波長在8000Å到幾十分之一毫米光譜區(qū)的儀器就已經(jīng)有了，但紅外光譜研究的真正進展卻發(fā)生在1940年以后。這個光譜區(qū)含有象分子振動所包括的那樣一些頻率的光。原子質(zhì)量、鍵強和分子構型這樣一些重要因素與所吸收的能量有聯(lián)系。因此某些波段易與OH、NH、C=C和C=O那樣一些基團相對應。
紅外光譜的興起靠的是發(fā)展熱電堆以及輻射計、放大器和記錄器方面所取得的進展。許多年來，這些儀器的光學部分比檢測和記錄機構要令人滿意得多。
紅外光譜主要是作為一種定性工具使用的。同時如果大量的日常分析工作——比如，工業(yè)實踐中常常必需的分析工作——證明紅外光譜有利于這種工作的操作的話，那么它也可用于定量分析。定量紅外光譜法已經(jīng)用于分析硝基烷混合物。甲酚混合物和六氯化苯異構體方面。六氯化苯的γ—異構體可用作殺蟲劑。紅外光譜法已經(jīng)是測定混雜有相關異構體的γ—六氯化苯的有用工具。紅外光譜法在定性分析中極有價值，因為吸收位置和吸收強度能提供大量數(shù)據(jù)。過去人們曾做了大量的工作，繪制了許多鍵和基的光吸收性質(zhì)圖，使得有可能利用這種數(shù)據(jù)迅速確定出新化合物的結構。工業(yè)方面，紅外光譜也有助于研究聚合作用方面的進展，因為單體和聚合體的紅外吸收帶相互間是有區(qū)別的。 目前紅外光譜（IR）是給出豐富的結構信息的重要方法之一，能在較寬的溫度范圍內(nèi)快速記錄固態(tài)、液態(tài)、溶液和蒸氣相的圖譜。紅外光譜經(jīng)歷了從棱鏡紅外、光柵紅外，目前已進入傅里葉變換紅外（FT—IR）時期，積累了十幾萬張標準物質(zhì)的圖譜。FT—IR具有光通量大、信噪比高、分辨率好、波長范圍寬、掃描速度快等特點。利用IR顯微技術和基本分離技術（matrixisolation，MI—IR）可對低達ng量和pg量級的試樣進行記錄，F(xiàn)T—IR和色譜的結合，被稱為鑒定有機結構的“指紋”，這些優(yōu)點是其他方法所難于比擬的。紅外光譜近年來發(fā)展十分迅速，在生物化學高聚物、環(huán)境、染料、食品、醫(yī)藥等方面得到廣泛應用。
（三）熒光分析
當紫外光照射到某些物質(zhì)的時候，這些物質(zhì)會發(fā)射出各種顏色和不同強度的可見光，而當紫外光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。
第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色，在17世紀，Boyle（1626—1691）和Newton（1624—1727）等著名科學家再次觀察到熒光現(xiàn)象，并且給予更詳細的描述。盡管在17世紀和18世紀中還發(fā)現(xiàn)了其它一些發(fā)熒光的材料和溶液，然而在解釋熒光現(xiàn)象方面卻幾乎沒有什么進展。直到1852年Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍為長些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦物“螢石”推演而提出“熒光”這一術語。Stokes還對熒光強度與濃度之間的關系進行了研究，描述了在高濃度時以及外來物質(zhì)存在時的熒光猝滅現(xiàn)象。此外，他似乎還是第一個（1864年）提出應用熒光作為分析手段的人。1867年，Goppelsröder）進行了歷史上首次的熒光分析工作，應用鋁—桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。1880年，Liebeman提出了最早的關于熒光與化學結構關系的經(jīng)驗法則，到19世紀末，人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光化合物。
20世紀以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多了。例如，1905年Wood發(fā)現(xiàn)了共振熒光；1914年Frank和Hertz利用電子沖擊發(fā)光進行定量研究；1922年Frank和Cario發(fā)現(xiàn)了增感熒光；1924年Wawillous進行了熒光產(chǎn)率的絕對測定；1926年Gaviola進行了熒光壽命的直接測定等等。
熒光分析方法的發(fā)展，與儀器應用的發(fā)展是分不開的。19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺光電熒光計。早期的光電熒光計的靈敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方面，是一個非常重要的階段。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校正步驟，1948年由Studer推出了第一臺自動光譜校正裝置，到1952年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器。
近十幾年來，在其它學科迅速發(fā)展的影響下，隨著激光、微處理機和電子學的新成就等一些新的科學技術的引入，大大推動了熒光分析法在理論方面的進展，促進了諸如同步熒光測定、導數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定、熒光偏振測定、熒光免疫測定、低溫熒光測定、固體表面熒光測定、熒光反應速率法、三維熒光光譜技術和熒光光纖化學傳感器等熒光分析方面的某些新方法、新技術的發(fā)展，并且相應地加速了各式各樣新型的熒光分析儀器的問世，使熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準確度和選擇性日益提高，方法的應用范圍大大擴展，遍及于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護、公安情報和科學研究等各個領域中。如今，熒光分析法已經(jīng)發(fā)展成為一種重要且有效的光譜化學分析手段。 在我國，50年代初期僅有極少數(shù)的分析化學工作者從事熒光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，熒光分析法已引起國內(nèi)分析界的廣泛重視，在全國眾多的分析化學工作者中，已逐步形成一支從事這一領域工作的隊伍。近年來，國內(nèi)發(fā)表的有關熒光分析方面的論文數(shù)量增長較快，所涉及的內(nèi)容也已從經(jīng)典的熒光分析法逐步擴展到新近發(fā)展起來的一些新方法和新技術，在儀器應用方面也陸續(xù)有幾種類型的國產(chǎn)的熒光分析光度計問世，為這一分析方法的發(fā)展和普及提供了一定的物質(zhì)條件。
（四）原子吸收光度法
20世紀50年代初又發(fā)展出了原子吸收光度法。這是吸收光度法的又一次重大突破。這種方法的初始形式是將試樣溶液霧化，噴入火焰，使霧滴溶劑迅速蒸發(fā)，形成溶質(zhì)固體微粒。它很快熔化、揮發(fā)，并被熱解為組成原子。這時利用一束銳線輻射穿過一定厚度的待測試樣蒸氣，輻射的一部分便被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子所吸收。對透過的輻射，經(jīng)單色器后，測定其減弱的程度。這樣利用在一定條件下消光度與火焰中原子濃度成正比的關系，求得待測元素的含量。
原子吸收共振光譜線的性質(zhì)很早就被觀察到。1802年，英國化學家武拉斯頓就曾觀察到太陽光譜中存在著許多暗線。對這種現(xiàn)象，英國光學家布魯斯特（David Brewster，1781—1868）對此作出了科學解釋。但是對此現(xiàn)象付諸應用，則是20世紀的事情。
1953年，澳大利亞物理學家沃爾什（A.Walsh）正式提出利用原子吸收光譜建立新的吸收光度法，并于1954年在墨爾本物理研究所展示出了第一臺簡單的原子吸收分光光度計。次年，他發(fā)表了專題論文《原子吸收光譜在化學分析中的應用》，從理論上探討了這種方法。在此同時，荷蘭化學家阿克馬德（J.T.J.Alkemade）也報導了采用原子火焰的吸收實驗，指出原子吸收可以做為一個普遍應用的分析方法。到1958年，這種方法便有了實際應用，例如，這年化學家德威得（D.J.Dvid）發(fā)表了他用原子吸收法測定植物中鋅、鎂、銅、鐵等元素的實驗報告。但在50年代，這種方法主要還僅在澳大利亞進行研究。
作為原子吸收法的一個關鍵性問題是如何使待分析物質(zhì)充分原子化，并形成穩(wěn)定的原子蒸氣。這就需要提高原子化裝置的溫度。在最初時，沃爾什是將試樣作成圓筒狀空心陰極，通過放電和陰極濺射而原子化。當時也有人利用火焰光度法中所常用的煤氣—空氣和丙烷—空氣的低溫火焰。其后又有人利用氫—空氣或乙炔—空氣。但對耐高溫化合物，這些火焰的溫度都嫌不足。到1965年，化學家維利斯（J.B.Willis）提出用乙炔—氧化亞氮火焰；曼寧（D.C.Maning）提出用乙炔—氧化氮火焰，它們的溫度皆可高達近3000℃，這樣就使測定Be、Al、Si、Ti、Zr、V、Sc、稀土等元素有了可能。1968年和1969年馬斯曼（H.Massmann）和蘇聯(lián)科學家呂沃夫（Б.В.Львов）分別研究了石墨管原子化法（非火焰法）。他們將試樣放于密閉的石墨管中（兩端裝石英窗），充以惰性氣體，用交流電加熱產(chǎn)生原子蒸氣，這樣既可達到較高的溫度，又可使吸收層中沒有氧（有利于氧化物試樣熱解），并且這種裝置可以使試樣中待測元素都進入吸收光路中，因而提高了分析的絕對靈敏度。1969年威斯特（T.S.West）則提出采用電加熱炭絲而使試樣原子化的方法，效果也很好。
作為原子吸收法的另一個關鍵問題是光源設計。它既需要有高穩(wěn)定性和強輻射能力，又能發(fā)出強烈的待測元素共振線輻射，并且沒有自吸收和連續(xù)背影。至今原子吸收光度計中最常用的光源是空心陰極燈。在20世紀初，這種光源就被用來研究原子光譜。1955年，克勞斯懷特（H.M.Crosswhite）等發(fā)展了這種光源。制造陰極內(nèi)壁用的材料一般就是高純的待測元素，對低熔點金屬元素，則采用其合金。管中充以氬或氖氣。當兩極施加電壓后，引起陰極濺射，濺射出來的原子再與氬、氖原子或離子碰撞而被激發(fā)發(fā)光。另外一種光源是充以某些元素蒸氣的放電燈。這類元素都是較易揮發(fā)的，例如堿金屬和汞。 原子吸收光度法因為具有靈敏、快速、簡便、準確、經(jīng)濟、適應普通等諸多優(yōu)點，所以發(fā)展極快，只在十幾年中就幾乎在冶金、化工、地球化學、農(nóng)業(yè)、生化和藥物研究各實驗室中得到普及。
（五）發(fā)射光譜
發(fā)射光譜的發(fā)展比其它任何領域都要迅速。早在1920年，它的應用就達到了很高的水平。用于鑒定金屬和非金屬的實際操作法已獲得了發(fā)展，這表明除了單質(zhì)氣體、硫和鹵素之外所有物質(zhì)都可以進行普通分析操作。這種技術的靈敏度達到百萬分之幾，對鑒定痕量雜質(zhì)非常有用。 定量分析隨著底片、儀器和操作手續(xù)的規(guī)格化變得實際可行了，每種元素的含量都可通過比較不同元素的某些發(fā)射譜線的密度來確定。這種比較起初是目視進行的。后來出現(xiàn)了顯微光度計，銀在底片上沉積的密度就可以精確測量了。定量和定性發(fā)射光譜很適合大規(guī)模的日常分析操作。小規(guī)模的臨時光譜操作在解釋問題上存在著困難，要花很大的費用；而使用其它某些分析技術卻較付錢雇幾位解釋者要好些，合算些。
大型工業(yè)光譜實驗室正越來越傾向于完全自動化地去解釋和記錄結果。在高分辨率的光譜儀中，光電管安置在待測元素的重要譜線會出現(xiàn)的位置，當發(fā)射光通過儀器后，經(jīng)過適當?shù)姆糯?、計算和記錄，幾秒鐘后就可得到復印的結果記錄。這種自動化程度自然需要大量的投資和精心的保養(yǎng)，并且還要限制待分析元素的數(shù)目和種類，不能任意改變。然而，在每天都能生產(chǎn)出許多批相似合金的工業(yè)操作中，工時和勞力的節(jié)省會使這種大型投資較為合算。 主要由中性原子的譜線組成的電弧光譜和主要由離子的譜線組成的火花光譜很久以來就是分析工作的實用光譜?；鹧婀庾V盡管是由較少量的低能躍遷譜線組成，但它完全適用于許多分析工作，特別是堿金屬和堿土金屬的分析，不過因為他們的譜線又弱又不穩(wěn)定，所以一般不用于定量分析。 1929年以后，產(chǎn)生了兩種操作法，使火焰光譜的應用得到了擴展。拉梅奇介紹過一種火焰法，用來分析土壤提取物和植物灰分，分析中利用了石英噴燈中的氧煤氣焰，這種噴燈設計成可使吸飽樣品的濾紙卷送入火焰。大約與此同時，倫德加德也發(fā)明了一種儀器，把呈細流的溶液引到乙炔—壓縮空氣火焰里，他自稱成功地對32種金屬作了定量測定。以上兩種方法對鉛、鋅和汞那樣一些金屬卻不敏感?；趥惖录拥略淼幕鹧婀庾V儀已有商品出售，它們對鈉和鉀的日常分析測定特別有用。60年代以后，利用光電倍增管為接受器的多道光譜儀問世，使光譜定量分析的速度和自動化程度大為提高。
